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Td techniques detudes et identification microbiennes

TD microbiologie Techniques d ? étude et d ? identi ?cation microbiennes Etude microscopique L ? examen microscopique débute par une préparation à l ? état frais Etat Frais Principe Cet examen permet d ? apprécier la forme et parfois la mobilité des germes étudiés Il faut éviter de confondre la mobilité d ? une bactérie avec les mouvements de convention susceptibles de l ? entra? ner Technique Cette préparation consiste à examiner les microorganismes vivants entre lame et lamelle Une goutte de suspension bactérienne est déposée au centre de la lame puis déposer une lamelle audessous en évitant de créer les bulles d ? air L ? observation se fait par microscope optique aux grossissements x et x Lecture Cet examen permet de savoir si on a a ?aire à une bactérie à un champignon ?lamenteux ou à une levure Dans le cas des levures et moisissures l ? examen permet une étude morphologique satisfaisante L ? étude morphologique des bactéries nécessite la préparation d ? un frottis coloré selon la méthode de la coloration de Gram Coloration de Gram But Permet de diviser les bactéries en groupes Gram celles qui retiennent le violet de gentiane après le lavage à l ? alcool et Gram- celles qui sont décolorées et prennent ensuite la couleur d ? un second colorant Principe Cette méthode est basée sur la di ?érence de structure de la paroi chez les groupes forte proportion de lipides chez les gram ?? et faible chez les Gram Le traitement par l ? alcool extrait les lipides chez les Gram - entra? nant une augmentation de la perméabilité de la paroi et l ? extraction du complexe iode violet de gentiane Ceci provoque la décoloration des organismes Les parois des Gram au contraire sont déshydratées par l ? alcool leur perméabilité diminue et le colorant ne peut être extrait Technique ?? Préparation du frotti prélèvement par une pipette pasteur ou une anse de platine de quelques gouttes ou une parcelle de la colonie à étudier et la déposer sur une lame propre et l ? étaler ?? Fixation Pour tuer les germes ?xer leurs structures cytologiques sans altération et augmenter la perméabilité membranaire aux colorants Elle peut se faire par la chaleur l ? alcool- ether ou l ? acide osmique ?? Coloration proprement dite Quelques gouttes de solution aqueuse de violet de gentiane sont répandues sur le frotti puis l ? excès du violet est jeté après une minute de contact Ensuite le frotti est recouvert de lugol de Gram cette liqueur prend une teinte mordorée on la jette au bout de quelques secondes C ?? Décoloration La lame est ensuite décolorée à l ? alcool qui sera versé goutte à goutte jusqu ? à ce qu ? il n ? est plus d ? action décolorante ?? Coloration de contraste Après lavage à l ? eau de robinet le frotti est recoloré à la fushine de Ziehl au pendant mn puis lavé à l ? eau