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Pdf etude experimentale de la phosphataase alcaline enzymologie 2

Etude expérimentale de la phosphatase alcaline Enzymologie Cabaret Laurine Martin Laetitia Groupe C CI Introduction Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d ? une enzym d ? étudier l ? in uence de la concentration en substrat et de la présence d ? un inhibiteur su vitesse de réaction Dans ce TP nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline d veau Il s ? agit d ? une enzyme alcaline à substrats capable d ? hydrolyser les monoesters phosphoriques selon la réaction suivante R-O -PO - H O R- OH HPO - II Principe A ?n de suivre la réaction enzymatique nous allons réaliser un dosage spectrophotomét des produits apparus dans le milieu lorsque l ? enzyme est en présence de son substrat faciliter le dosage nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate PNPP qui après action de l ? enzyme libère un produit coloré jaune le P-nitrophénol PNP directement dosable à nm OH HPO PNPP incolore Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l ? absorbance d ? une subst colorée au cours du temps Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d ? enregistrem ordinateur qui nous permet de visualiser l ? évolution de l ? absorbance dans un interval temps min et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique gr? c pente de la droite obtenue dans les temps initiaux ?DO min De plus pour conna? tre la quantité de produit apparu dans le milieu on réalise une gam étalon de tubes contenant di ?érente concentration connues de produit On trace la dr CDO f PNP En reportant l ? absorbance d ? une solution de concentration inconnue on peut en déduire sa concentration III Manipulations préliminaires A ?n de réaliser la gamme étalon et les milieux d ? incubation nous devons préalablemen préparer les solutions de substrats de concentrations di ?érentes Solution de PNPP Nous voulons préparer tubes de solution de PNPP à mM mM mM mM mM mM à partir d ? une solution mère de mM Pour cela nous e ?ectuons u dilution en cascade mL mL mL mL mL mL mM ? mM mM mM mM mM C PNPP mM umol L Solution mère mL H mL mM mM mM mM mM mM Calcul pour la première dilution C V C V V mL Donc V C V C V mL Il faut donc prélever mL de la solution mère et ajouter mL d ? eau pour la diluer fo Solution de glycérophosphate Comme précédemment nous voulons préparer tubes de solution de glycérophosphat mM et mM à partir d ? une solution mère à mM mL mL mM GRO -P mM Solution mère mL H mL mM mM mM mM CCalcul pour la première dilution C V C V Vf mL Donc V CV C V mL Il faut donc prélever mL de la solution mère et ajouter mL d ? eau pour la diluer fois IV Etude cinétique de la libération