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Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 1/2

Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 1/20 Tutorat Santé Lyon Sud UE1 Enzymologie Cours du Professeur K. CHIKH L’ensemble des cours du Professeur K. CHIKH fait habituellement l’objet de 2 QCMs au concours. Le présent support de cours fourni par le Tutorat Santé Lyon Sud est destiné à faciliter votre prise de notes mais ne constitue en aucun cas une référence pour le concours. Seuls les cours ayant été dispensés par les enseignants et les supports mis à disposition par leurs soins sont légitimes. Veuillez prendre note que seul les polycopiés directement téléchargés depuis Spiral Connect sont certifiés en provenance du tutorat, toute autre source est potentiellement compromise. Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 2/20 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) SOMMAIRE I. POUVOIR CATALYTIQUE ET CINETIQUE DES ENZYMES .................................................................................... 3 I.A. GENERALITES ....................................................................................................................................................... 3 1. Nature et rôle ................................................................................................................................................. 3 2. Constitution d'un complexe enzymatique ...................................................................................................... 3 3. Notion de site actif ......................................................................................................................................... 3 4. Modèles d’interaction .................................................................................................................................... 4 I.B. CATALYSE ENZYMATIQUE ........................................................................................................................................ 4 1. Aspect thermodynamique .............................................................................................................................. 4 2. Mécanismes moléculaires de la catalyse enzymatique .................................................................................. 5 I.C. CINETIQUE ENZYMATIQUE ...................................................................................................................................... 6 1. Définitions ...................................................................................................................................................... 6 2. Étapes ............................................................................................................................................................ 8 3. Expression mathématique de la vitesse initiale : équation de Michealis-Menten .......................................... 8 4. Constante de Michaelis km ............................................................................................................................. 9 5. Constante catalytique kcat ............................................................................................................................ 10 6. Représentations graphiques ........................................................................................................................ 10 7. Influence des paramètres réactionnels sur la vitesse initiale ....................................................................... 11 II. REGULATION DE L'ACTIVITE DES ENZYMES .................................................................................................. 12 II.A. REGULATION PAR MODIFICATIONS COVALENTES ...................................................................................................... 12 1. Régulation par protéolyse partielle .............................................................................................................. 12 2. Régulation par fixation de groupes fonctionnels ......................................................................................... 13 II.B. REGULATION PAR ALLOSTERIE............................................................................................................................... 13 1. Enzymes allostériques .................................................................................................................................. 13 2. Vitesse initiale et allostérie .......................................................................................................................... 14 3. Phénomène de coopérativité ....................................................................................................................... 14 4. Régulation par rétrocontrôle négatif (ou rétroinhibition ou feedback négatif)............................................ 15 III. MESURE DE L'ACTIVITE DES ENZYMES ........................................................................................................ 15 III.A. PRINCIPE ......................................................................................................................................................... 15 III.B. CONDITIONS EXPERIMENTALES ............................................................................................................................ 16 III.C. MODALITES DE MESURE ..................................................................................................................................... 17 III.D. RESULTATS ...................................................................................................................................................... 17 III.E. INTERET MEDICAL .............................................................................................................................................. 17 IV. LES ISOENZYMES ET LEUR INTERET EN BIOLOGIE ........................................................................................ 18 V. COENZYMES ET VITAMINES ........................................................................................................................ 18 V.A. CARACTERISTIQUES GENERALES DES COENZYMES ..................................................................................................... 18 V.B. ROLE METABOLIQUE........................................................................................................................................... 19 Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 3/20 I. POUVOIR CATALYTIQUE ET CINETIQUE DES ENZYMES I.A. GENERALITES 1. Nature et rôle Les enzymes sont le plus souvent des protéines et parfois des ARNr (ribozymes). Elles ont un rôle de catalyseurs biologiques : elles accélèrent les réactions chimiques dans les systèmes biologiques d'un facteur 106 au minimum. Exemples : - OMP decarboxylase (synthèse des bases pyrimidiques): 1017 - Nucléase staphylococcique : 1014 - Anhydrase carbonique : 106 Les enzymes sont hautement spécifiques de la réaction catalysée et du substrat transformé. Cette spécificité est toutefois relative : Exemples : enzymes protéolytiques - subtilisine (origine bactérienne) : liaison X-X (avec X = n’importe quel AA. La subtilisine est donc très peu spécifique car elle agit sur n’importe quelle liaison peptidique). - trypsine : Arg-X et Lys-X - thrombine : Arg-Gly 2. Constitution d'un complexe enzymatique On appelle holoenzyme l'ensemble apoenzyme + cofacteur :  L'apoenzyme est la partie protéique thermolabile (c’est-à-dire qu’avec la chaleur les liaisons entre les acides aminés sont cassées : perte de l’activité biologique). L’apoenzyme peut être un chaîne unique ou un oligomère.  Le cofacteur est la partie non protéique thermostable : - Ions métalliques : Anhydrase carbonique + Zn2+, ADN polymérase + Mg2+ - Groupements prosthétiques ou coenzymes vrais : petites molécules organiques fortement liées au site actif de l'enzyme (liaisons covalentes) - Coenzymes mobiles ou co-substrat : petites molécules organiques capable de se fixer réversiblement au site actif de l'enzyme. 3. Notion de site actif L'interaction entre E et S ne concerne que quelques acides aminés : c'est le site actif de l'enzyme. Il y a complémentarité spatiale (forme 3D) et physique (formation de liaisons faibles entre des groupements voisins) entre le site actif et le substrat, assurant ainsi la spécificité de l'interaction ES. Le site actif se divise en 2 groupes d'acides aminés : - un groupe de reconnaissance spatiale et d'établissement de liaison - un groupe de transformation chimique du substrat : site catalytique Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 4/20 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) Exemple : site actif du lysozyme Rôle de clivage des sucres sur les parois bactériennes. C’est la première ligne de défense contre les bactéries : il rompt la chaine polyosidique des bactéries : le glutamate donne un proton : rupture de la chaine, puis hydrolyse car H2O donne un H+ au glutamate. 4. Modèles d’interaction Modèle clé-serrure de Fischer (1890) : structure rigide de l’enzyme qui s’adapte rigoureusement au substrat. Ce modèle a évolué et n’est plus d’actualité. Modèle actuel de Koshland (1957) : modification conformationnelle de E lors de l'association à S, permettant une orientation optimale des groupes catalytiques : on parle d’adaptation induite. I.B. CATALYSE ENZYMATIQUE 1. Aspect thermodynamique Les enzymes accélèrent les réactions en diminuant l'énergie libre d'activation (car plus elle est élevée et plus la réaction est lente): Les enzymes ne peuvent pas rendre possible une réaction endergonique (∆G > 0), elles ne catalysent que des réactions exergoniques (∆G < 0). De plus, les enzymes ne déplacent pas l’équilibre de la réaction qui ne dépend que de ΔG (les concentrations en substrats et en produits à l’équilibre restent identiques), l’équilibre est juste atteint plus vite. Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 5/20 Une enzyme n’est jamais modifiée après une réaction. 2. Mécanismes moléculaires de la catalyse enzymatique Exemple de la chymotrypsine La chymotrypsine est une enzyme protéolytique pancréatique, elle clive les liaisons Phe-X et Trp-X. Le site actif contient une triade catalytique (Ser– His – Asp) comportant une sérine activée par déprotonation (élément le plus actif du site) : famille des sérines protéases. Etapes : - Déprotonation de Ser, qui devient un ion alkoxyde et qui attaque le substrat et forme une liaison covalente - Clivage de la liaison Phe –X après intervention de His - Obtention d’un intermédiaire acyl-enzyme et libération du premier produit - Attaque d’un H2O sur la liaison Ser – Phe qui la rompt - Libération d’un autre produit Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 6/20 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017)  L'enzyme retrouve sa forme d'origine ! Exemple : Anhydrase carbonique L’anhydrase carbonique est une enzyme intervenant dans la régulation acido-basique de l’organisme (balance CO2 HCO3-). Elle contient un ion zinc responsable de l'activation d'une molécule d'eau permettant d’hydrater le CO2 pour former un ion carbonate HCO3-. I.C. CINETIQUE ENZYMATIQUE 1. Définitions Nous nous limiterons dans le cadre de ce cours à un cas simple d'enzyme possédant un seul site actif et catalysant la réaction d'un seul substrat. La cinétique réactionnelle est définie par la vitesse réactionnelle v telle que : v = ( d[P] dt ). Vitesse initiale : On définit également, à un temps très proche de 0, la vitesse initiale v0 : v0 = ( d[P] dt ) t=0. Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 7/20 La vitesse initiale correspond à la vitesse au tout début de la réaction (t ≈ t0), constante tant que les conditions initiales sont maintenues (c’est-à-dire tant que Δ[S] et [P] sont négligeables, en pratique, consommation de moins d'1 % du substrat). C'est la vitesse d'intérêt mesurée lors de l'étude la cinétique des enzymes. Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 8/20 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 2. Étapes 1. Formation d'un complexe ES (enzyme-substrat) 2. Catalyse Succession de réactions intermédiaires permettant la transformation du substrat en produit. Dans les conditions initiales, la réaction « retour » (et donc la constante k-2) est négligeable. k2 est appelée kcat (ou constante catalytique). L’enzyme retrouve toujours son état initial à la fin de la réaction et peut donc catalyser une nouvelle réaction. On peut écrire ainsi l'ensemble du processus : L'étape de catalyse étant très lente devant la formation du complexe ES (environ 1000 fois plus lente), on négligera k1 et on admet une nouvelle expression de la vitesse initiale : v0 = ( d[P] dt ) t=0= kcat[ES]. 3. Expression mathématique de la vitesse initiale : équation de Michealis-Menten Evolution des concentrations au cours de la réaction : L'état pré-stationnaire correspond à la formation du complexe ES (imperceptible en réalité). L'état stationnaire correspond aux conditions initiales, c'est cette période qui nous intéresse. Enzymologie | Biologie moléculaire • UE1 Tutorat Santé Lyon Sud (2016-2017) 9/20 Equation de Michaelis-Menten : Vmax : Lorsque toutes les enzymes sont complexées par du substrat (substrat saturant), alors la vitesse initiale pour une réaction donnée est maximale : v0 = vmax. Donc vmax = kcat x [E]0. L’équation de Michaels-Menten peut alors s’écrire : 4. Constante de Michaelis km La valeur km est une caractéristique d’un couple enzyme substrat et dépend des conditions expérimentales (pH, température…). Les valeurs de km sont souvent comprises entre 10-1 et 10-7 M. Exemples : Relation entre Km et l’affinité d’une enzyme pour son substrat : Km est inversement uploads/Finance/ enzymologie.pdf