Clonage moléculaire Université de Mostaganem Abdelhamid Ibn Badis Faculté des S

Clonage moléculaire Université de Mostaganem Abdelhamid Ibn Badis Faculté des SNV Département de Biologie L3 Biochimie Assuré par : Dr. DAHMANI C.A Plan des cours • Chapitre I Rappel sur les bases du génie génétique. • Chapitre II Introduction au génie génétique • Chapitre III Outils enzymatique du génie génétique. • Chapitre IV Cartes et enzymes de restriction • Chapitre V Clonage moléculaire. • Chapitre VI Techniques d’analyse du génome , amplification génique (PCR), séquençage : Les banques génomiques et les banques d’ADNc. • Chapitre VII Hybridation moléculaire, sondes et marquage d’ADN. • Chapitre VIII Applications biotechnologiques de l’ADN recombinant. Clonage moléculaire • Le clonage moléculaire est différent du : • clonage reproductif (individus génétiquement identiques) • clonage thérapeutique (tissus à partir de cellules souches pour effectuer des greffes compatibles avec le receveur par exemple). Types de clonage • Le clonage moléculaire consiste à : l’insertion d’une séquence d’ADN (insert) dans un vecteur puis son introduction dans une cellule-hôte afin d’en obtenir plusieurs copies. Clonage moléculaire Définition Vecteur Linéaire circulaire Cellule hôte Procaryote Eucaryote Fragment d’ADN ADNg génomique ADNc complémentaire Clonage moléculaire Éléments nécessaires Clonage moléculaire Définition Vecteur Linéaire circulaire Cellule hôte Procaryote Eucaryote Fragment d’ADN ADNg génomique ADNc complémentaire Clonage moléculaire Éléments nécessaires Types de vecteurs Les vecteurs LES PLASMIDES Les plasmides • Certains plasmides, dits «NAVETTE», ont deux origines de réplication, procaryote et eucaryote, et peuvent donc se répliquer dans les deux types de cellules. Les plasmides Les classes de plasmides • Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie génétique. • Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au laboratoire. Les classes de plasmides • Les pBR sont des plasmides non naturels, ils résultent de plusieurs modifications « plasmides artificiels ». • Deux gènes de résistance aux antibiotiques (mp et Tétra). Les classes de plasmides • La famille des pUC est dérivée des plasmides pBR322 (pUC18, pUC19). • Gène de résistance à l’ampicilline. • Gène LacZ Les plasmides 3ème génération Origine de réplication • L’origine pMB1 conserve environ 20 copies par cellule, tandis que • L’origine pUC, produira jusqu'à 700 copies par cellule. Structure d’un bactériophages Tête Queue Mais tous les bactériophages ne répondent pas à ce modèle classique Structure d’un bactériophages Structure d’un bactériophages • On peut les réunir en quatre grands groupes morphologiques : I. les phages à ADN bicaténaire, avec queue (Phage λ et Phage T4) II. les phages sans queue, à symétrie cubique et à ADN monocaténaire (Phage T7) III. les phages à ARN IV. les phages filamenteux à ADN monocaténaire (Phage M13). Structure d’un bactériophages Structure d’un bactériophages • Deux phages sont très utilisés comme vecteurs : le phage λ et le phage M13 qui infectent tous les deux E. Coli. Aujourd’hui, les vecteurs phages sont dérivés de ces deux types. • Les séquences utilisés de ces phages sont connues (40 à 50 kb d'ADN double brin). Les propriétés des phages • A chaque extrémité 5’ de l’ADN se trouve une région monocaténaire de 12 nucléotides l’une complémentaire à l’autre. Ils forment des extrémités cohésives et leurs associations donne une structure circulaire à l’ADN dans la cellule hôte. • Ces séquences sont appelées séquences cos. Les propriétés des phages Carte génétique du phage λ Multiplication des phages Multiplication des phages Cycle lytique Multiplication des phages Lysogénie Multiplication des phages Lysogénie et induction Multiplication des phages Résumé Carte génétique du phage λ Multiplication des phages Gènes activés • Avantages : • Taille des inserts est supérieure à celle des plasmides. • La transfection bactérienne (incorporation des phages) est mille fois plus efficace que pour les plasmides. • Inconvénients : • Nombre de sites de restriction réduit dans le génome des phages • Contrainte de taille exigée pour l’ADN à insérer (10 à 23Kb). Utilisation des phages PANORAMA DEL HENARES martes, agosto 20, 2019 LES COSMIDES • C’est un vecteur artificiel hybride : • C’est un plasmide comprenant les extrémités cos du phage λ, permettant d’infecter les bactéries Escherichia coli, dans les quelles ils se multiplient de façon autonome. Les Cosmides Structure Les Cosmides Structure Un site cos d’un virus lambda a été inclus dans leur ADN circulaire ce qui permettra au cosmide d’être empaqueté dans la tête d’un virus lambda. Génome du cosmide Clonage moléculaire par cosmide Site Cos ORI Polylinker Ampr Vecteur Cosmide ≈ 5 Kb Fragments de restriction génomiques ≈ 35 à 45 Kb Clonage moléculaire par cosmide Fragments de restriction génomiques ≈ 35 à 45 Kb Couper les vecteurs (cosmides) avec une enzyme de restriction au niveau du polylinker Clonage moléculaire par cosmide Liguer les vecteurs coupés avec les fragments d’ADN génomiques Clonage moléculaire par cosmide Clonage moléculaire par cosmide Clonage moléculaire par cosmide Clonage moléculaire par cosmide Clonage moléculaire par cosmide • Avantages : • Taille des inserts est supérieure à celle des phages. • La transfection bactérienne est plus efficace. • Inconvénients : • Obligation d’empaqueter l’ADN à cloner. Utilisation des cosmides • Les chromosomes artificiels (ou mini-chromosomes) sont des structures qui copient les chromosomes de la cellule eucaryote et se répartissent régulièrement lors des divisions, comme les chromosomes naturels. Les chromosomes artificiels On y retrouve donc les éléments essentiels des chromosomes:  Une origine de réplication qui est en phase avec les origines chromosomiques naturelles.  Une région centromérique qui assure la migration correcte du mini-chromosome.  Un site unique de clonage  Un ou plusieurs marqueurs de sélection Les chromosomes artificiels Les YACs (Yeast Artificial Chromosom) • C’est un vecteur utilisé pour cloner des fragments d'ADN de 100- 3000kb. • Les YAC sont utiles pour la cartographie physique des génomes complexes et pour le clonage de gènes de grande taille. • Décrit pour la première fois en 1983 par Murray et Szostak Les YACs (Yeast Artificial Chromosom) Un bras YAC contient : une séquence de réplication autonome (ori yeast), un centromère (CEN) et un marqueur de sélection. L'autre bras contient un deuxième marqueur de sélection (bacteria). Les YACs (Yeast Artificial Chromosom) Clonage moléculaire pYAC3 Clonage pYAC3 Clonage pYAC3 Clonage pYAC3 Sélection après clonage pYAC3 • Les recombinants sont les colonies rouges qui se développent dans une cellule de levure mutante pour trp1 et ura3. • L'insertion d'ADN dans le site de clonage inactive un gène du YAC Les BACs (Bacteria Artificial Chromosom) • Les BAC sont des ADN circulaires, comme un chromosome bactérien L’origine de réplication est issue de l’épisome sexuel F d’E.coli (plasmide impliqué dans la conjugaison bactérienne). • Le vecteur BAC contient : 1. Une origine de réplication 2. Des gènes de multiplication du plasmide 3. Un site de clonage 4. Un marqueur de sélection Les BACs (Bacteria Artificial Chromosom) • OriS est l'origine de réplication de l'épisome F. • Les gènes parB/parA servent à la répartition correcte de l'épisome dans les cellules filles. • Le gène repE code l'enzyme de réplication spécifique de l'épisome. Les BACs (Bacteria Artificial Chromosom) • CmR d'origine plasmidique code résistance au chloramphénicol. • CosN vient du bactériophage λ. Ce site est reconnu et ouvert par la terminase in vitro. • Ce plasmide est à faible nombre de copies (comme le facteur sexuel F). Les BACs (Bacteria Artificial Chromosom) Clonage au niveau des BACs Clonage au niveau des BACs Clonage au niveau des BACs Clonage au niveau des BACs uploads/Finance/ universite-de-mostaganem-abdelhamid-ibn-badis-clonage-moleculaire.pdf

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• Publié le Apv 12, 2022
• Catégorie Business / Finance
• Langue French
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