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Université Libanaise Faculté de santé publique Université Libanaise Ecole Doctorale de Sciences et Technologies UNIVERSITÉ LIBANAISE Faculté de Santé Publique Mémoire - Master 2 Recherche Caractérisation moléculaire de gène et des protéines des résistance Présenté par SARA EL OWAYED Pour l’obtention du Master Recherche en Maladies Infectieuses : Outils avancés en diagnostic, typage et bio-informatique appliquée Soutenu le ………. Devant le jury composé de Pr. Monzer HAMZE Responsable du stage Dr. Rayan RAFEI Rapporteur Dr. Marwan OSSMAN Examinateur Travail réalisé au Laboratoire de l’Hôpital Bicêtre – Université Paris Sud, Faculté de Médecine - EA 7361 : Structure, Dynamique, Fonction et Expression des ß-lactamases à spectre large. Sous la direction de : Dr. Monzer Hamzeh au Liban & Dr. Thierry Naas en France Dédicace I Dédicace Je dédie ce travail…. A mon époux Bilal ALI Aucune dédicace ne pourrait exprimer mon amour et mon attachement à toi. Depuis que je t’ai connu, tu n'as cessé de me soutenir et de m'épauler. Tu me voulais toujours le meilleur. Ton amour ne m'a procuré que confiance et stabilité. Tu as partagé avec moi les meilleurs moments de ma vie, aux moments les plus difficiles de ma vie, tu étais toujours à mes côtés, Je te remercie de ne m'avoir jamais déçu. Aucun mot ne pourrait exprimer ma gratitude, mon amour et mon respect. Mes fils, Baraa et Ryan, C'est à vous mes adorables anges, ma joie, mes petits trésors que maman dédie ce travail pour vous dire que vous resterez toujours le rayon du soleil qui égaye ma vie. A ma chère Mère Source inépuisable de tendresse, de patience et de sacrifice. Ta prière et ta Bénédiction m'ont été d'un grand secours tout au long de ma vie. Quoique je puisse dire et écrire, je ne pourrais exprimer ma grande affection et ma profonde reconnaissance. J'espère ne jamais te décevoir, A mon cher Père De tous les pères, tu es le meilleur. Tu as été et tu seras toujours un exemple pour moi par tes qualités humaines, ta persévérance et perfectionnisme. En témoignage des années de sacrifices, de sollicitudes, d’encouragement. En ce jour, j'espère réaliser l'un de tes rêves. Aucune dédicace ne saurait exprimer mes respects, ma reconnaissance et mon profond amour. A mes chers frères Mohamad, AL Moetassem, Abdo Rahman ma fierté dans cette vie. A ma tendre, gentille et adorable sœur Diaa. A ma chère amie Imane EL Ratel, Je la remercie pour l’encouragement, le soutien, et l'aide qu’elle m’a donnée et tous les moments qu’on a passé ensemble. Remerciements II Remerciements Tout d'abord, j'adresse mes remerciements au directeur du mémoire et coordinateur du master, PR. Monzer Hamze qui s’est toujours montré à l’écoute. Je tiens à exprimer ma reconnaissance pour sa générosité, sa grande patience, sa confiance en moi, sa disponibilité et surtout l’autonomie qu’il m’a offert pendant ce stage. Il m’a donné une chance de continuer ce master et travailler avec une équipe très expérimentée dans l’antibiorésistance. Je tiens à remercier vivement Dr. Thierry Naas, chef de l’unité de recherche de l’Université Paris Sud EA7361 pour son accueil et l’opportunité en or qu’il m'a donnée. Je remercie aussi Dr. Rayan AL Rafeii pour son soutien continu et ses conseils précieux. Je désire aussi remercier Dr. Saoussen Ouslati qui m’a fourni les informations et outils nécessaires au bon déroulement de mon stage. Elle a été toujours disponible pour m’expliquer tous, répondre à mes questions et m’aider à résoudre les problèmes quotidiens auxquels nous sommes confrontés. Les deux mois que j’ai passé avec elle m'ont permis d'acquérir des connaissances de terrain indispensables pour les fonctions auxquelles je me destine. Cette expérience constituera un atout important pour mon futur parcours professionnel. Je remercie aussi Garance, Elodie, Camille et tous les membres de l'équipe de l’unité EA7361 : Structure, Dynamique, Fonction et Expression des β-lactamases à spectre large en France qui ont su m'accueillir avec gentillesse et bienveillance. Grâce à eux, j'ai pu découvrir et partager le quotidien d'une équipe sympathique, rigoureuse et dynamique ce qui m’a permis de travailler en toute confiance dans un climat agréable et détendu. Résumé III Résumé On étudie dans ce projet un nouveau gène blaBOE-4 codant pour une β- lactamase de classe A isolé à partir d’une souche de Pseudomonas aeruginosa provenant du centre national de référence (CNR) de l'hôpital de Besançon. Le gène blaBOE-4 codant pour cette enzyme, a été amplifié par PCR puis cloné dans le vecteur d'expression pET41b. Le vecteur recombinant a été introduit par transformation, dans Escherichia coli BL21. Ce vecteur, permet l’expression de la protéine BOE-4 uniquement par ajout de l’IPTG. L'absence de contrôle positif nous a empêchés de préciser notre protéine d'intérêt. Dans la deuxième partie de ce projet nous avons analysé 32 souches Bactérie Multirésistante (BMR) présentant une sensibilité diminuée aux β-lactamines, isolées aux services de néonatologie de l'hôpital d’Ibn Rochd au Maroc entre les années 2019 et 2020. Tout d’abord, ces bactéries sont isolées sur milieu URI4, ensuite leur identification est confirmée par Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation/Time Of Flight (MALDI-TOF). La détermination de la sensibilité aux antibiotiques est obtenue par la réalisation d’antibiogramme (technique des disques), et par des tests biochimiques (test B-lacta et Carba NP). Afin de caractériser le type de β-lactamases exprimées, des tests immunochromatographie NG-CTXM et NG Carba5 ont été réaliser, ces tests ont révélé que 68,8 % des souches avaient une résistance enzymatique de type β-lactamase à spectre étendu (BLSE) et plus précisément de type CTX-M. Ainsi qu’une résistance enzymatique aux carbapénèmes est observée chez 18,8 % de souches, dont 66% (IMP, OXA-23), 17%(VIM), 17% (VIM, NDM).). Le test Alere ™ PBP2 révèle que 50% des souches Staphylococcus aureus (S. aureus) résistants aux méticillines par l'acquisition de PLP2A. Une analyse next-generation sequencing (NGS) sera par la suite réalisée afin d’identifier un lien épidémiologique entre elles. Enfin, les souches devront être caractérisées et typées puis comparées afin d’identifier un lien épidémiologique entre elles, ce qui nous permettra de proposer des mesures, afin de limiter leurs diffusions à l’hôpital. Résumé IV Mots clés : BOE-4, clonage, BMR, BLSE, carbapénèmases. Abstract IV Abstract In this project, we are studying a new BOE-4 gene encoding a class A β- lactamase isolated from a strain of P. aeruginosa from the national reference center (CNR) of the hospital in Besançon. The blaBOE-4 gene encoding this enzyme was amplified by PCR and then cloned into the expression vector pET41b. The recombinant vector was introduced by transformation into E. coli BL21. This vector allows the expression of the BOE-4 protein only by adding IPTG. The lack of a positive control prevented us from specifying our protein of interest. In the second part of this project, we analyzed 32 BMR strains with reduced sensitivity to β-lactams, isolated in the neonatology departments of Ibn Rochd hospital in Morocco between 2019 and 2020. First of all, these bacteria are isolated on URI4 medium, then their identification is confirmed by MALDI-TOF. The determination of the sensitivity to antibiotics is obtained by carrying out the antibiogram (disc technique), and by biochemical tests (B-lacta and Carba NP test). In order to characterize the type of β-lactamases expressed, NG-CTXM and NG Carba5 immunochromatography tests were carried out, these tests revealed that 68.8% of the strains have an enzymatic resistance of the extended spectrum β-lactamase type (ESBL). and more precisely of the CTX-M type. As well as enzymatic resistance to carbapenems in 18.8% of strains, including 66% (IMP, OXA-23), 17% (VIM), 17% (VIM, NDM).). The Alere ™ PBP2 test reveals that 50% of S. aureus strains resistant to methicillins by acquisition of PLP2A. An NGS analysis will then be performed in order to identify an epidemiological link between them. Finally, the strains will have to be characterized and typed and then compared in order to identify an epidemiological link between them, which will allow us to propose measures to limit their dissemination to hospitals. Key words: BOE-4, cloning, BMR, ESBL, carbapenemases Abréviations V Abréviations Degré ° Degré Celsius °C Acinetobacter baumannii A. baumannii A. baumannii résistantes à l'imipenème ABRI Amoxicilline, acides clavulanique AMC Amikacine AMK Amoxicilline AMX Acide désoxyribonucléique ADN AnTiBiotique ATB AzTreonaMe ATM BELgium ESBL BEL Brazilian Extended-spectrum β-lactamase BES Bromure d Ethidium BET Bacilles Gram Négatifs BGN Brain Heart Infusion BHI β-lactamase Bla β-lactamase à spectre étendu BLSE Bactéries multirésistante BMR Céphalosporine de 3ème génération C3G Comité de l’Antibiogramme- Société Française de Microbiologie CA-SFM Céftazidime CAZ Center for Disease Control CDC Cocci Gram positives CGP Concentration Minimale Inhibitrice CMI Centre nationaux de référence CNR Céfotaximase-Munic CTXM Diméthylsulfoxyde DMSO Désoxyribonucléotides dNTP Enterobacter cloacae E. cloacae Escherichia coli E. coli European Antimicrobial Resistance Surveillance System EARSS Entérobactéries productrices de BLSE E-BLSE European Centre for Disease Control ECDC Éthylènediaminetétraacétique EDTA European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing EUCAST Food and Drug Administration FDA Céfoxitine FOX Abréviations VI Fluoroquinolones FQ Guyana Extended-Spectrum β-Lactamas GES Imipenème IMP Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG InSertion sequence IS Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight MALDI-TOF Métallo-β-lactamase MBL Minute Min Millilitre Ml MultiLocus Sequence Typing MLST New Delhi métallo-β-lactamase NDM Next Generation Sequencing uploads/Geographie/ memoire-sara-el-owayed.pdf