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NNT : 2017SACLA011 THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY PREPAREE A L’

NNT : 2017SACLA011 THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY PREPAREE A L’INSTITUT DES SCIENCES ET INDUSTRIES DU VIVANT ET DE L'ENVIRONNEMENT (AGROPARISTECH) ÉCOLE DOCTORALE N°581 Agriculture, alimentation, biologie, environnement et santé Spécialité de doctorat : Génétique Animale Par Melle Pauline Michot Utilisation des séquences de génome complet pour l'identification de mutations délétères responsables d'anomalies génétiques récessives chez le bovin Directeur de thèse : Didier Boichard & Aurélien Capitan Thèse présentée et soutenue à Paris, le 29 Mars 2017 : Composition du Jury : M. Etienne VERRIER Professeur, AgroParisTech, Paris Président Mme Carole CHARLIER. Maître de recherche du FNRS, Université de Liège Rapporteur Mme Jeanne AMIEL PUPH, Institut Imagine Hôpital Necker, Paris Rapporteur Mme Catherine ANDRE Chargée de recherche, CNRS, Université de Rennes 1 Examinateur M. Laurent SCHIBLER Responsable Développement & Innovation., ALLICE, Paris Examinateur M. Didier BOICHARD Directeur de recherche, INRA, Jouy en Josas Examinateur 2 3 Remerciements Tous ceux qui ont suivi mon parcours de thèse savent à quel point je suis soulagée de pouvoir enfin écrire les dernières lignes de ce document. Il achève un peu plus de trois ans de travaux au sein de l’INRA de Jouy-en-Josas, parfois difficiles et moralement éprouvants sur la fin, mais sur une thématique de recherche toujours aussi passionnante. Aussi, je souhaite adresser mes plus profonds et sincères remerciements à toutes les personnes rencontrées au cours de ma thèse, qui ont contribué à mes travaux et fait de ces trois années une expérience professionnelle et humaine extrêmement enrichissante. Tout d’abord, je remercie mes directeurs de thèse, Aurélien Capitan et Didier Boichard, qui m’ont donné la chance de pouvoir entreprendre cette thèse et sans qui ce document n’aurait pu voir le jour. Un profond merci à vous deux pour vos enseignements, le partage de vos connaissances scientifiques, de recherche et de votre passion pour la génétique. Merci pour votre confiance et votre soutien tout au long de ma thèse, malgré quelques moments de doute. J’ai eu beaucoup de chance de la réaliser sous votre direction. A Xavier David, directeur d’ALLICE, et Laurent Schibler, responsable R&D ; j’adresse mes très sincères remerciements pour la confiance et l’accueil que vous m’avez accordés dans la réalisation de ce projet de thèse au sein d’ALLICE. Je remercie aussi l’ensemble du personnel de l’entreprise pour les échanges toujours chaleureux. Je remercie l’ANRT et APIS-GENE qui ont co-financé ma thèse dans le cadre d’un contrat CIFRE, ainsi que l’Agence Nationale de la Recherche et APIS-GENE pour le financement du projet BOVANO. Merci à l’ensemble de l’équipe G2B et personnels de l’INRA avec qui j’ai pu travailler ou simplement échanger au cours de ces trois années. Plus particulièrement à Sébastien Fritz, mon directeur de stage de fin d’étude, merci encore pour tous vos conseils et vos encouragements ; à Cécile Grohs, véritable « Maman labo », merci pour votre implication dans les projets de cette thèse, votre aide, votre écoute et conseils à la paillasse, sans oublier non plus votre amitié et vos encouragements. A tous les collègues, doctorants et stagiaires de l’étage et/ou du rez-de-chaussée du 211 - en particulier Chris, Romain, Laure, Thierry, Alexis, Iola, Gabriel – merci pour les échanges et discussions au sein de l’équipe, merci pour votre amitié, les conversations animées des pauses café, les moments « geek » et batailles de nerfs, les blagues vraiment pas drôles, les afterworks Baradoz… Merci pour tous ces bons moments qui vont me manquer. Je vous souhaite à tous une très bonne poursuite dans vos différents projets. Mentions spéciales à mes trois co- bureaux successifs, Marine, Alexis et enfin Rabia pour quelques semaines de rédaction pas les plus drôles pour moi. Merci à vous pour ce partage toujours dans une bonne ambiance. Une pensée à tous mes amis de Bourgogne, de prépa, de l’agro, des USA qui n’ont jamais très bien compris mon sujet de recherche ou bien même l’utilité d’une thèse, mais toujours présents pour décompresser. Pour finir, un immense merci à l’ensemble de mes proches qui m’ont soutenue. A mes parents, anciens éleveurs de Charolaises, qui m’ont transmis la passion de l’élevage, à mon grand-frère, exemple et soutien depuis toujours; à ma belle-sœur pour ses conseils, et mon copain qui m’a supportée et soutenue dans ces mois de rédaction ; merci à vous tous du fond du cœur pour votre patience, vos conseils et votre force. A nouveau, à toutes les personnes citées ci-dessus ou non, merci. 4 Mots clés : génomique, mutations délétères, anomalies, bovins Résumé L’effectif génétique réduit des races bovines entraîne une augmentation de consanguinité de l’ordre de 1% par génération et une forte dérive génétique. Cette évolution favorise l’émergence régulière d’anomalies génétiques récessives dans les populations, qu’elles soient de races laitières ou allaitantes. En France, l’Observatoire National des Anomalies Bovines (ONAB) a été créé dans le but de détecter et contrôler ces anomalies émergentes. Cependant, la détection par les observatoires sous-entend d’une part une diffusion large de l’allèle défavorable dans la population et d’autre part que l’anomalie présente un phénotype avec un tableau clinique spécifique permettant sa déclaration à l’ONAB. L’impact des anomalies génétiques est donc encore largement sous-estimé. Toutefois, les développements des technologies de génotypage et de séquençage de génomes, associés à l’ensemble des informations disponibles permettent une détection efficace des mutations causales. Ainsi, l’objectif de cette thèse a été d’utiliser l’ensemble des données disponibles (phénotypes, génotypes, séquences, annotations fonctionnelles…) pour identifier et valider des mutations délétères ségrégant dans races bovines laitières et allaitantes françaises. Nous avons exploré différentes stratégies classiques - cartographies par homozygotie, haplotypes en déficit en homozygotes - qui gagnent en efficacité grâce aux données de séquence de génome complet (WGS). Nous avons également mis en place des approches alternatives de génétique inverse, basées sur l’exploitation des données WGS françaises et du consortium « 1000 bull genomes ». Les travaux réalisés ont permis d’identifier les mutations causales associées à deux syndromes récessifs rapportés à l’ONAB : l’épidermolyse bulleuse jonctionnelle en race Charolaise (ITGB4, chr19: g.56488278_56493087del) et l’épilepsie idiopathique (MTCL1, chr24:g.41661691G>A) récemment émergée dans la race Parthenaise. Nous avons également démontré la forte association entre l’haplotype MH1 et un polymorphisme affectant le gène PFAS (chr19:g.28511199C>T ; p.R1205C). Par les stratégies de génétique inverse, nous avons également identifié une mutation probablement responsable de mortalité embryonnaire en race Normande affectant le gène CAD (chr11 :g72399397, p.Y452C) ainsi qu’une mutation affectant le gène RP1 (chr14:g.23995411_23995412insA, p. R791KfsX13) responsable d’une dégénérescence progressive de la rétine qui ségrége à forte fréquence en race Normande mais aussi dans d’autres races bovines européennes. Ces études encore en cours, fournissent également un inventaire des variants génétiques potentiellement délétères dont la caractérisation de l’effet sur le phénotype pourra être explorée. Enfin, l’identification de ces anomalies et des mutations délétères responsables ont abouti à la mise à disposition de tests de diagnostic efficaces pour permettre une contre sélection raisonnée de ces variants délétères dans les populations bovines. 5 Keywords: genomic, deleterious mutations, anomalies, bovine Abstract The reduced genetic size of cattle breeds leads to an 1% increase in inbreeding per generation and a strong genetic drift. This evolution favors regular emergences of recessive genetic abnormalities in dairy and beef cattle breeds. In France, the National Observatory of Bovine Anomalies (ONAB) was created with the aim to detect and control these new emergences. However, detection by the observatories implies a broad diffusion of the deleterious allele in the population as well as a phenotype with a specific clinical features, which allows reporting of the anomaly to the ONAB. Therefore the impact of genetic anomalies is still largely underestimated. However, development of genotyping and genome sequencing technologies, coupled with all available information, allows effective detection of causal mutations. Thus, the aim of this thesis was to use all the available data (phenotypes, genotypes, sequences and functional annotations) to identify and validate deleterious mutations segregating in French dairy and beef cattle breeds. We explored various classical strategies, such as homozygosity mapping and search for haplotypes displaying a deficit in homozygotes, which gained efficiency with whole genome sequence (WGS) data. We also implemented alternative reverse genetics strategies, based on data mining of French and “1000 bull genomes” consortium WGS data. In these different studies, we identified the causal mutations associated with two recessive syndromes: epidermolysis bullosa junctional in Charolais breed (ITGB4, chr19: g.56488278_56493087del) and idiopathic epilepsy (MTCL1, chr24:g.41661691G>A) recently emerged in the Parthenaise breed. We also demonstrated a strong association between the embryonic lethal mutation MH1 and a polymorphism affecting the PFAS gene (chr19: g.28511199C> T ; p.R1205C) in Montbeliarde cattle. With reverse genetic strategies, we identified another mutation in the CAD gene (chr11: g72399397, p.Y452C), likely responsible for embryonic mortality in Normande cattle and a frameshift mutation in RP1 (chr14:g.23995411_23995412insA, p. R791KfsX13) responsible for progressive retinal degeneration segregating with a high frequency in the Normand breed and also in other European cattle breeds. These studies, still in progress, provide an inventory of potentially deleterious genetic variants, the characterization of them could be explored in the future. At last, identification of mutations responsible for these genetic abnormalities provides effective diagnostic tests and allows uploads/Geographie/ michot-2017-archivage.pdf