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- 1 - CHIMIE THÉORIQUE ET PHYSIQUE APPLIQUÉE À L’ANALYSE STRUCTURALE DES BIOMOL

- 1 - CHIMIE THÉORIQUE ET PHYSIQUE APPLIQUÉE À L’ANALYSE STRUCTURALE DES BIOMOLÉCULES (CG 204) Prof. B. Wathelet UNITÉ DE CHIMIE BIOLOGIQUE INDUSTRIELLE Prof. M. Paquot NOTES DE TRAVAUX PRATIQUES - Séances de laboratoire Dr. A. Richel, Ir. S. Gillet - 2 - Technique 1. LC-MS 1. Préparation des échantillons  Echantillon solide inconnu par infusion directe Vous recevez 1 solide que vous analyserez sous forme de pastille en IR et par infusion directe en MS. Préparer une solution à 0,1 % d'acide formique (HFo) dans de l'eau milliQ (attention HFo est très corrosif, à préparer sous hotte). Dans un eppendorf, peser environ 0,1 mg de votre produit et ajouter 1 ml de la solution précédente. Bien dissoudre votre produit à l'aide de l'agitateur à vortex. Centrifuger le tube eppendorf 5 minutes à 13.000 tpm en veillant à équilibrer le rotor avec un autre eppendorf rempli de 1 ml. Prélever 0,8 ml (sans prélever au fond) et transférer dans un nouvel eppendorf. Analyser l'échantillon par infusion directe.  Echantillon de myoglobine Dans un eppendorf, préparer une solution mère de myoglobine à 1mg par ml de l’eau mQ. Bien dissoudre votre produit à l'aide de l'agitateur à vortex. Centrifuger le tube eppendorf 5 minutes à 13.000 tpm en veillant à équilibrer le rotor avec un autre eppendorf rempli de 1 ml. Prélever dans le surnageant pour les dilutions suivantes : 1. 10µl de solution mère de myoblobine + 990µl d’eau mQ avec 0,1% de HFo (attention HFo est très corrosif, à préparer sous hotte) 2. 10µl de solution mère de myoblobine + 990µl de formate d’ammonium 10mM (63,06mg/100ml d’H2O mQ) 3. 10µl de solution mère de myoblobine + 990µl de bicarbonate d’ammonium 10mM (79,06mg/100ml d’H2O mQ) Analyser les trois échantillons par infusion directe et comparer les résultats. - 3 - Noyau hème avec O2 et histidine proximale : C34H32N4O4Fe MMaver.=616,48 MMmonois.=616,17 Séquence de la myoglobine : Myoglobine du muscle de cheval P68083. 10 20 30 40 50 60 MGLSDGEWQQ VLNVWGKVEA DIAGHGQEVL IRLFTGHPET LEKFDKFKHL KTEAEMKASE 70 80 90 100 110 120 DLKKHGTVVL TALGGILKKK GHHEAELKPL AQSHATKHKI PIKYLEFISD AIIHVLHSKH 130 140 150 PGDFGADAQG AMTKALELFR NDIAAKYKEL GFQG MM sans Met (MMMet-H2O = 131) : 17.083 – 131 = 16.952 MM myoglobine (avec hème) = 16.952 + 616 = 17.568 - 4 -  Etude en infusion et en LC-MS d’un mélange de 5 peptides Solution à 5 µg/ml de chaque peptide dans l’eau à 0.1% d’acide formique Gly-Tyr MM=238.2 Val-Tyr-Val MM=379.5 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met MM=573.7 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu MM=555.6 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe MM=1046.2  Hydrolyse trypsique de la myoglobine 1. Préparation de l’apomyoglobine La myoglobine est difficile à hydrolyser. Pour faciliter son hydrolyse, on enlève le noyau hème. Elle devient de l’apomyoglobine. Préparer une solution de myoglobine à environ 1% Ajuster le pH à 1,5 par ajout de HCl 1N à 0°C Ajouter un volume égal de 2-butanone Agiter 5 minutes à 4°C Laisser reposer 30 minutes Enlever la couche de 2-butanone qui contient le hème Encore répéter 2 fois l’extraction à la 2-butanone Lyophiliser la phase aqueuse 2. Hydrolyse trypsique (Cterm Arg et Lys) dans un eppendorf, peser environ 0,1 mg d’apomyoglobine (6 nmol) ajouter 2µl de solution de trypsine TPCK salt free à 1mg/ml de NH4HCO3 10mM ajouter 600µl de solution de NH4HCO3 10mM agiter 30" à l'agitateur vortex laisser réagir une nuit à T° ambiante (environ 15h) diluer 50 fois dans H2O à 0,1% HFo avant l'analyse (20µl d'hydrolysat + 980µl de H2O à 0,1% HFo) - 5 - 2. Description de l’appareillage  Partie HPLC - 6 -  Partie MS - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - - 12 - Total Ion Chromatogram (TIC) Base Peak Chromatogram (BPC) Ion Extracted Chromatogram (IEC) - 13 - - 14 - Certificate of Analysis Electrospray Calibrant Solution Agilent Part Number: G2421-60001 Sample Lot Number: A136898 Concentration (weight to volume) and Purity/Grades: Neat material Neat Material Gravimetric Conc. Purity and/or Grade Betaine (CAS NO.: 107-43-7) < 0.01% 99.40% Trifluoroacetic Acid Ammonium Salt (CAS NO.: 3336-58-1) < 0.01% 98.60% Hexamethoxyphosphazene (CAS NO.: 957-13-1) < 0.01% 99.10% Hexakis(2,2-Difluoroethoxy)Phosphazene (CAS NO.: 186817-57-2) < 0.01% 98.50% Hexakis(1H, 1H, 3H-Tetrafluoropropoxy)Phosphazene (CAS NO.: 58943-98-9) < 0.01% 97.50% Hexakis(1H, 1H, 5H-Octafluoropentoxy)Phosphazene (CAS NO.: 16059-16-8) < 0.01% 99.00% Hexakis(1H, 1H, 7H-Dodecafluoroheptoxy)Phosphazene (CAS NO.: 3830-74-8) < 0.01% 99.00% Hexakis(1H, 1H, 9H-Perfluorononyloxy)Phosphazene (CAS NO.: 186043-67-4) < 0.01% 99.00% Tris (heptafluoropropyl)-S-Triazine (CAS NO.: 915-76-4) < 0.01% 99.10% Solvent Composition: Acetonitrile (CAS NO.: 75-05-8) 95.0% HPLC grade 99.9% DI Water (CAS NO.: 7732-18-5) 5.0% De-ionized Traceability: This standard has been produced gravimetrically using ISO9001 quality procedures. . NIST traceable weights are used to verify balance calibration with the preparation of each lot. Concentration of analyte in solution is ug/ml +/- 0.5%, uncertainty based upon balance and Class A volumetric glassware. High- performance liquid chromatography mass spectroscopy was used to evaluate system performance. Analytical Spectrum or Chromatogram: Fragmentation Pattern Calibration - 15 - Agilent 1100 Series LC system: Agilent 1100 Series LC/MSD: G1354A Quaternary Pump (includes degasser) G1946D LC/MSD SL G1313A Automatic liquid Sampler (ALS) G1948A API-Electrospray source G1947A APCI source G2421A Electrospray Tuning Calibrant Column: None Column Temp: N/A Flow Rate: 0.4ml/min Mobile Phase: 75:25 Acetonitrile/Water Ionization Mode: Positive Electrospray Nebulizer Pressure: 40 psi Drying Gas Flow: 10L/min Drying Gas Temp: 350 deg C Scan Range: 50-3000 Step Size: 0.15amu Date of Manufacture: 09 FEBURARY 2006 Date of Expiration: 09 FEBURARY 2008 Elwood Doughty QA Manager Supelco, Inc. Masses + H+ 118.09 322.05 622.03 922.01 1521.97 2121.93 2721.89 - 16 - Technique 2. MALDI-TOF Un instrument de type MALDI-TOF est un spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une matrice (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) et un analyseur à temps de vol (TOF, time-of-flight mass spectrometry). 1. Préparation des échantillons Etapes de la préparation : Sélection de la matrice Préparation de la matrice Préparation de l’échantillon Mélange de l’échantillon et de la matrice Chargement de l’échantillon Séchage 2. Préparation de la matrice Table 1. Matrice courantes Matrice Applications Acide sinapinique (SA) (3,5-Dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid) Peptides et protéines > 10.000 Da Acide -cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA) Peptides/proteins < 10.000 Da 2,4,6-Trihydroxy acétophenone (THAP) Petits oligonucléotides < 3.500 Da, carbohydrates acides, glycopeptides acides, composés sensibles aux acides Acide 3-hydroxypicolinic (3-HPA) dans le citrate d’ammonium Grands oligonucleotides > 3.500 Da Acide 2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB) Peptides, carbohydrates neutres ou basiques, glycolipides (ions négatifs), polymères synthétiques polaires et non-polaires, petites molécules Acide 2,5-dihydroxybenzoic et acide 5- methoxysalicylique (DHBs) Peptides and proteines > 10.000 Da, protéines glycosylées Dithranol and Ag TFA Polymères aromatiques Acide trans-3-indoleacrylic (IAA) Polymères non-polaires La solution de matrice doit être fraîche. Certaines matrices se dégradent sous l’influence de la lumière ou de l’humidité. - 17 - Table 2. Solutions de matrice pour 1 volume d’échantillon et 10 volumes de matrice. Matrice Concentration Concentration finale Solvant et préparation Acide sinapinique (SA) 10 mg/ml 0,1-5 pmol/µl 300 µl acétonitrile + 700 µl d’eau déionisée avec 0,1 % de TFA (préparation journalière) Acide -cyano-4- hydroxycinnamic (CHCA) 10 mg/ml 0,1-5 pmol/µl 500 µl acétonitrile + 500 µl d’eau désionisée avec 0,1 % de TFA 2,4,6-Trihydroxy acétophenone (THAP) Oligonucléotides : 10 mg/ml Carbohydrates acides : 2 mg/ml 1-10 pmol/µl 500 µl acétonitrile + 500 µl d’eau désionisée On peut ajouter du di-ammonium citrate. Acide 2,5- dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB) 10 mg/ml 10 pmol/µl Eau désionisée. Table 3. Pics de la matrice observés dans les spectres Matrice Pics de la matrice SA 202,1 224,1 225,1 CHCA 172,0 190,0 212,0 294,1 379,1 THAP 169,1 DHB 137,1 154,1 155,0 273,1 3. Analyse de l’albumine bovine (BSA)  Préparation étalons de protéines II. Etalonner avec la solution «Protein calibration standard II » Solution TA : CH3CN / H2O à 0,1% de TFA (v /v, 2 :1) (TFA = acide trifluoroacétique, attention très corrosif, travailler sous hotte) Solution de matrice SA : 10 mg d’acide sinapinique (SA) dans 1 ml de TA, agiter 1’ à l’agitateur vortex, centrifuger 1’ à 10.000 tpm Solution étalon de base : tube avec mélange de protéines II + 125 µl H2O 0,1 % TFA (agitateur vortex) Solution à déposer : 5 µl d’étalon de base + 5 µl de solution de matrice SA (agitateur vortex) Dépôt étalon : 0,5 µl sur la cible et laisser sécher à l’air libre - 18 - [M+H]+ monoisotopique Trypsinogène 23.982 Da Protéine A 44.613 Da Albumine bovine env. 66,5 kDa Calculer les [M+2H]++ éventuels.  Préparation échantillon de BSA. Solution TA : CH3CN / H2O à 0,1% de TFA (v /v, 2 :1) (TFA = acide trifluoroacétique, attention très corrosif, travailler sous hotte) Solutions échantillons d’albumine bovine : 1 mg de BSA par ml de H2O à 0,1% de TFA. Agiter 1’ à l’agitateur vortex pour bien dissoudre. Effectuer des dilutions 5, 10, 20 et 100. Solution de matrice : 10 mg d’acide sinapinique (SA) dans 1 ml de TA, agiter 1’ à l’agitateur vortex, centrifuger 1’ à 10.000 tpm Solution à déposer : 10 µl de solution échantillon + 10 µl de solution de matrice (agitateur vortex) Dépôt échantillon : 0,5 µl sur la cible, laisser sécher à l’air libre MM  67.000 4. uploads/Industriel/ notes-de-travaux-pratiques-pdfdrive.pdf