Aperçu des principales colorations histologiques et intérêt pour le pathologist

Aperçu des principales colorations histologiques et intérêt pour le pathologiste Julie Hinsinger Plateforme d’Histologie _ IRIC Les colorations histologiques: colorations de routine et colorations spéciales LES ETAPES depuis le prélèvement jusqu’au bloc Le plus souvent, le matériel histologique est fixé, inclus, coupé et coloré afin de pouvoir l’observer au microscope. Le matériel peut être prélevé par biopsie ou provenir d’une pièce opératoire ou d’une autopsie. La fixation a pour buts la conservation des structures et le durcissement des tissus. Elle doit se faire immédiatement après le prélèvement, par immersion du matériel dans du fixateur (généralement le formaldéhyde = formol). L’inclusion a pour but la réalisation de coupes histologiques. Le milieu d’inclusion le plus utilisé est la paraffine. Comme la paraffine est hydrophobe, le prélèvement doit d’abord subir une déshydratation (par immersion dans des bains d’alcool), puis est immergé dans des bains de toluène puis est infiltré par la paraffine fondue par chauffage (circulation) avant d’être coulé dans un moule contenant de la paraffine fondue (inclusion). Après refroidissement, on obtient d’un bloc de paraffine, dur, à l’intérieur duquel la pièce prélevée est incluse. LES ETAPES depuis le prélèvement jusqu’au bloc Circulation du tissu imprégnation à la paraffine Étapes Réactifs Durée (min) Température (ºC) 1 Fixateur 200 < 40 2 Éthanol 50% 20 45 3 Éthanol 30 45 4 Éthanol 40 45 5 Éthanol 40 45 6 Éthanol 50 45 7 Éthanol 100% 50 45 8 Toluène 45 45 9 Toluène 45 45 10 Toluène 45 45 11 Paraffine 60 60 12 Paraffine 60 60 13 Paraffine 60 60 LES ETAPES depuis le bloc jusqu’à la lame colorée Les coupes du bloc de paraffine sont réalisées avec un microtome permettant d’obtenir des sections (coupes histologiques) de 3 à 5 microns d’épaisseur. Les coupes sont recueillies sur des lames de verre et mises à sécher (sur la nuit à 40-45°C ou 1H max 60°C). - La plupart des tissus sont transparents Les colorations réalisées sur lames, accentuent les contrastes pour pouvoir reconnaître différents éléments du tissu. LES ETAPES DE LA COLORATION - Déparaffinage (toluène / xylène - éthanol) - Hydratation - Coloration à proprement dit (routine ou spéciale) - Déshydratation (éthanol) - Éclaircissement (toluène / xylène) La paraffine est insoluble dans l’eau et l’alcool, mais soluble dans les hydrocarbures tels que le toluène, xylène. Le pathologiste et le choix des colorations Dans l’hôpital, le pathologiste joue un rôle important car c’est à partir de son diagnostic que le traitement sera institué. La coloration de routine permet au pathologiste de se faire une idée de la pathologie présente et d’avoir une vision globale de la morphologie des tissus (noyau, cytoplasme et collagène). Il peut ensuite demander à revoir le même tissu mais cette fois avec un élément tissulaire particulier qui aura été mis en évidence de façon spécifique. On parle dans ce cas de colorations spéciales. Départements de Pathologie Ayez les bons outils de travail !!! Seule une bonne utilisation de contrôles adéquats permet d’obtenir des résultats explicables et reproductibles en histologie. Facteurs influant la distribution des colorants dans les tissus et la qualité de la lame en général Fixateur (pH, VOLUME, TEMPS), colorants (concentration, pureté (ACS_American Chemical Society), filtration, changement régulier des bains), l’épaisseur de coupe du tissu (trimming adéquat). Chaque étape (en amont ) est importante pour l’obtention du matériel d’analyse. Les colorations de routine (topographiques) H&E Les solutions d’hématoxyline contiennent de l’hématéïne et un mordant métallique (sels d'aluminium ou de fer). Ce mordant est responsable de la coloration. L’éosine colore les cytoplasmes en rose et les fibres dans une gamme de roses plus ou moins vifs selon l’acidophilie des différents éléments. collagène ................................................... rose pâle muscle ..................................................... rose foncé cytoplasme acidophile ..................................... rouge basophiles .................................................... pourpre noyaux ............................................................... bleu érythrocytes .......................................... rouge cerise Rein Poumon Les colorations de routine (topographiques) H&E -La chromatine devrait être bleue pourpre et bien distincte. -Les Nucleoles devraient être violacés. Microscopic Quality Control of Hematoxylin and Eosin http://www.dako.com/08066_12may10_webchapter15.pdf Polymorphonucléaire Plasmocytes Muqueuse colique Les colorations de routine (topographiques) HPS Hématoxyline Phloxine Safran (milieu francophone) collagène ............................................ Jaune orangé muscle ............................................................... rose cytoplasme……………...................................... rose noyaux ............................................................... bleu érythrocytes.................................................... Rouge JGH, HMR, Sacré Cœur bien que francophones demandent le HE. Colorant / Solvant Temps Xylène 5’00’’ Xylène 5’00’’ ABS ETOH 2’00’’ ABS ETOH 2’00’’ ABS ETOH 2’00’’ Lavage 0’20’’ Lavage 1’00’’ Hématoxyline 0’55’’ Lavage 0’20’’ Lavage 0’20’’ Bicarbonate Sodium 0.5% 0’20’’ Lavage 0’15’’ Lavage 3’30’’ Éosine 0’45’’ ETOH 95% 0’30’’ ABS ETOH 0’40’’ ABS ETHO 2’40’’ Xylène 2’00’’ Xylène 2’00’’ Xylène 2’00’’ Colorant / Solvant Temps Xylène 3’00’’ Xylène 3’00’’ ABS ETOH 2’00’’ ABS ETOH 2’00’’ ABS ETOH 2’00’’ Lavage 0’10’’ Lavage 0’40’’ Hématoxyline 0’50’’ Lavage 0’25’’ Bicarbonate Sodium 0.5% 0’12’’ Lavage 0’15’’ Lavage 3’00’’ Phloxine 0’15’’ Lavage 0’18’’ ETOH 95% 0’30’’ ABS ETOH 0’30’’ ABS ETHO 0’45’’ Safran 5’00’’ ABS ETOH 0’45’’ ABS ETHO 0’45’’ ABS ETOH 0’45’’ Xylène 0’45’’ Xylène 0’45’’ Xylène 1’00’’ Hématoxyline – Phloxine – Safran Hématoxyline – Éosine Les colorations spéciales Les colorations spéciales sont réalisées pour préciser des structures ou substances suspectées par le pathologiste lors de son analyse initiale sur les coupes de technique standard. Les techniques histochimiques sont basées sur des réactions biochimiques qui permettent de mettre en évidence in situ (= dans les tissus), différents constituants (lipides, glucides, protéines, acides nucléiques, métaux, etc). Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Les fibres conjonctives comprennent les fibres de collagène, de réticuline et les fibres élastiques. Les fibres de collagène sont les plus abondantes des 3. On en trouve partout dans l’organisme sauf dans le système nerveux central. Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Trichrome de Masson Cette coloration met en évidence les fibres de collagènes. Cette méthode est très populaire. Utile dans l’étude de la pathologie du cœur (infarctus), foie (cirrhose ) , rein (fibrose glomérulaire) La plupart des recettes colore en rouge la kératine et les fibres musculaires, en bleu ou vert le collagène et l’os, en rouge-clair ou rose les cytoplasmes, et en noir les noyaux de cellules. Résultats: Noyaux, chromatine et nucléole…..…..….bleu foncé à noir Cytoplasme……………………………………………………………rouge Globules rouges……………………………………………………..rouge Collagène…………………………………………………………………Bleu Artère Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Trichrome de Masson Cette coloration met en évidence les fibres de collagènes. Cette méthode est très populaire. Utile dans l’étude de la pathologie du cœur (infarctus), foie (cirrhose ) , rein (fibrose glomérulaire) La plupart des recettes colore en rouge la kératine et les fibres musculaires, en bleu ou vert le collagène et l’os, en rouge-clair ou rose les cytoplasmes, et en noir les noyaux de cellules. Résultats: Noyaux, chromatine et nucléole……….….bleu foncé à noir Cytoplasme……………………………………………………………rouge Globules rouges……………………………………………………..rouge Collagène…………………………………………………………………Bleu Déparaffiner et réhydrater Mordancer au Bouin 1H 56°C Refroidir et laver 20mn Hematox. Weigert filtrée Laver Biebrich scarlet fuchsine acide 2mn Laver Ac. Phosphomolibdique-phosphotungstique 10mn Bleu aniline 30-40 sec Rincer Acide acétique 1% Déshydrater, monter Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Cette coloration met en évidence les fibres de collagènes. Elle est parfois demandée en pathologie cardiovasculaire. MOVATT Noyaux ………………………………………………………….bleu à noir Cytoplasme ……………………………………………………………rouge Muscle…………………………………………………………………...rouge Collagène et fibres réticulaires-………………..jaune verdatre Fibrine ………………………………………………………rouge intense Mucine et substance de fond……….…………….bleu limette Os Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Cette coloration met en évidence les fibres de collagènes. Elle est parfois demandée en pathologie cardiovasculaire. MOVATT Noyaux ………………………………………………………….bleu à noir Cytoplasme ……………………………………………………………rouge Muscle…………………………………………………………………...rouge Collagène et fibres réticulaires.………………..jaune verdâtre Fibrine ………………………………………………………rouge intense Mucine et substance de fond……….…………….bleu limette Déparaffiner et réhydrater Bleu Alcian 15mn Laver 5mn Alcool alcalin 1H Laver 15mn et rincer Hématoxyline 12-15 mn Rincer et différencier dans chlorure de fer 2% 30s Thiosulfate sodium 1mn Laver Crocéine scarlet – ac. Fuchsine 2mn Rincer à l’eau distillée pls fois Rincer Acide acétique 0.5% 5% Ac. Phosphotungstique aqueux 2X 5mn Rincer Acide acétique 0.5% Rincer ds 3 bains ETOH abs. Safran 10mn Déshydrater, monter Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Coloration de Verhoeff Elle met en évidence le réseau de fibres élastiques. Cette coloration est utile dans le cadre des diagnostics de lésions dégénératives congénitales ou acquises (vergetures, élastose solaire), de vasculite (peut être demandée pour mettre en évidence la limitante élastique des vaisseaux), d’artérite temporale. Cette méthode est basée sur la coloration des fibres élastiques par l’hématéine combinée à l’iode et au chlorure ferrique. Résultats: Noyaux………………………………………………………...….gris à noir Fibres élastiques……………………………………………………..noir Cytoplasme……………………………..…selon contre-coloration Globules rouges………………………… selon contre-coloration Collagène……………………………………selon contre-coloration Peau Les colorations spéciales Mise en évidence des fibres conjonctives Coloration de Verhoeff Elle met en évidence le réseau de fibres élastiques. Cette coloration est utile dans le cadre des diagnostics de lésions dégénératives congénitales ou acquises (vergetures, élastose solaire), de vasculite (peut être demandée pour mettre en évidence la limitante élastique des vaisseaux), d’artérite temporale. Cette méthode est basée sur la coloration des fibres élastiques par l’hématéine combinée à l’iode et au chlorure ferrique. Résultats: Noyaux………………………………………………………...….gris à noir Fibres élastiques………..……………………………………………..noir Cytoplasme……………………………..…selon contre-coloration Globules rouges………………………… selon contre-coloration Collagène……………………………………selon contre-coloration Déparaffiner et réhydrater Hématéine Verhoeff 30mn coupesnoir Rincer à l’eau distillée pls fois Différencier au chlorure ferrique 2% Laver rapidement ETOH 95% Rincer Colorer au Van Gieson ou Éosine Déshydrater, monter uploads/Philosophie/les-colorations-histologiques.pdf

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