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Faculté des Sciences, de la technologie et de la communication - Bachelor BASV

Faculté des Sciences, de la technologie et de la communication - Bachelor BASV 1 La microscopie électronique La microscopie électronique TP BASV semestre 1 Séance 3 Champ d’utilisation des microscopes Suivant la dimension des échantillons à observer, il convient de choisir l’un ou l’autre microscope suivant la limite de résolution de chacun. Microscope électronique Microscope AFM Liaison C-C Glucose Hémoglobine Ribosome Mitochondrie Bactérie Globule rouge C. elegans Nouveau né Drosophile Organismes multicellulaires Cellules Macromolécules Petites molécules Atomes Microscope à effet tunnel Microscope optique Comparaison entre le microscope optique et électronique Le microscope électronique est beaucoup plus récent que le MO. Le premier ME a été construit en 1931, et il s'est répandu à partir des années 60. La résolution d'un microscope électronique peut atteindre 2 angströms (= 0,2 nm = 2.10 -10 m), mais généralement les meilleurs microscopes atteignent 20 angströms seulement (= 2 nm) Le principe de fonctionnement d'un microscope électronique ressemble un peu à celui d'un microscope optique: - la lampe est remplacée par une cathode chauffée qui envoie un faisceau d'électrons (à la place des photons) de relativement haute énergie dans une enceinte sous vide -les lentilles de verre sont remplacées par des bobines électromagnétiques. Composition du microscope électronique 2 types de microscopes électroniques Pulvérisation d’or ou de platine sur l’échantillon. Déflecteur qui permet le balayage. Les électrons traversent la préparation. L’image est formée par les électrons primaires. L’image est formée par les électrons secondaires et les électrons rétrodiffusés. Microscope électronique en transmission Echantillon Electrons déviés Le MET est basé sur l'émission de flux d'électrons qui traversent la préparation et donnent ainsi une image de la structure en 2 dimensions. Il est très utilisé pour obtenir des images d'organites ou de cellules. C'est celui qui donne la plus grande résolution. Microscope électronique en transmission Echantillon Electrons déviés Suivant la densité de l’échantillon, les électrons qui le traversent sont plus ou moins déviés. Les électrons fortement déviés n’atteignent pas l’écran fluorescent.  Les régions de l’échantillon plus denses apparaissent en noir. Microscope électronique en transmission Une image finale est obtenue en exposant une plaque photographique au flux d’électron ou un phosphore de haute résolution couplé, par de la fibre optique à une caméra. L’image est formée par les électrons, appelés électrons primaires sur un écran fluorescent qui permet l’orientation. Microscope électronique à balayage Au niveau du MEB, il existe 2 faisceaux d’électrons qui se déplacent de manière synchrone permettent de reconstituer une image de surface de la coupe (ou de l'objet/animal étudié) en 3 dimensions. Grâce à la diffusion ou l'émission d'électrons par la coupe uniformément recouverte d'une couche de métal lourd, l'image traduit le relief de cette couche. La résolution est beaucoup plus faible (10 nm). Microscope électronique à balayage En microscopie électronique à balayage, les électrons ne traversant pas l’échantillon. Ce dernier subit une vaporisation d’un métal lourd (or ou platine) à sa surface, propice à l’observation microscopique. Microscope électronique à balayage Les électrons primaires, en arrivant sur l’échantillon vont libérer des électrons secondaires, et des électrons rétro-diffusés, qui sont analysés par différents détecteurs . Le nombre d’électrons secondaires varie suivant l’angle d’incidence du faisceau. Plus l’angle est rasant, plus le volume excité est grand et plus la production d’électrons secondaires est importante. Microscope électronique à balayage Le canon à électron Elément de base du microscope pour arriver à l’accélération des électrons. Deux types de canons peuvent être distingués: le canon thermoélectronique et le canon à émission de champ (FEG). Le canon thermoélectronique est constitué de trois éléments: le filament (cathode), le Wehnelt et l’anode. Les électrons sont extraits du filament, portés à une certaine température, passent par le Wehnelt puis se retrouvent attirés par l’anode. Le Wehnelt possède un potentiel plus négatif (le Bias) que la cathode ce qui permet de contrôler l’émission du canon Le Bias Le canon à électron Les canons thermoélectroniques peuvent avoir trois types de filaments: tungstène (W), hexaborure de Lanthane (LaB6) et hexaborure de cerium (CeB6) L’accélération principale des électrons est due à la haute tension positive de l’anode. W LaB6 Sur les microscopes de 200 kV ou plus, l’accélération ne peut pas se faire en une seule étape. Au delà de 150 kV, des accélérateurs contenant plusieurs étages d’accélération augmentent la tension. Cette augmentation est de 40 kV par étage. La longueur d’onde du faisceau d’électrons La tension appliquée au microscope électronique détermine la longueur d’onde des électrons, et ainsi le pouvoir de résolution de l’appareil. Comme 1 joule = 107 cm2.g/sec2 on obtient l’équation suivante λ = h m*v La relation entre la longueur d’onde d’une particule de masse m, se déplaçant avec une vitesse v, est donnée par l’équation de De Broglie: λ = longueur d’onde h = constante de Plank La vitesse d’un électron pouvant être exprimé par l’ équation de son énergie cinétique 1 m*v2 2 = e*U soit m v 2*e*U = En substituant dans l’équation de De Broglie h2 2*m*e*U = λ = 2*e*U m h m 1 * en cas de tension élevé λ = 150 U Å λ = 150 U + 10-6*U2 Å La longueur d’onde du faisceau d’électrons λ = h m*v λ = longueur d’onde h = constante de Plank = 6,62 , 10-34 J m = 9,1.10 -31 kg e = 1,6,10-19 Coulomb La résolution du microscope électronique Le pouvoir de résolution est une propriété de l’instrument. Cette valeur est absolue et théorique. La résolution sera toujours égale ou inférieure au pouvoir de résolution. La valeur réelle va dépendre des conditions expérimentales.  Avec des échantillons biologiques (fragiles aux électrons), la résolution que l’on obtient peut être considérablement inférieure au pouvoir de résolution de l’instrument. La résolution des images de microscopie électronique est généralement limitée non pas par le pouvoir de résolution de l’instrument mais par le contraste. Le pouvoir de résolution des microscopes électroniques est, le plus couramment, de l’ordre de 0,2-0,3 nm, alors que, pour la plupart des échantillons biologiques, la limite de résolution est de l’ordre de 1 à 5 nm. Le contraste des images dépend de la nature et de l’intensité des interactions qui ont lieu entre le faisceau d’électrons et l’échantillon. La résolution du microscope électronique La résolution du microscope électronique Les aberrations des lentilles électromagnétiques Tout comme en microscopie optique, le faisceau d’électron traversant les lentilles électromagnétiques est sujet à toutes sortes d’aberrations: L’aberration sphérique De manière similaire au système optique, les électrons traversant la lentille sur l’extérieur du faisceau sont d’avantage déviés que les électrons traversant la lentille en son intérieur. Ces aberrations sont corrigées par la forme des pièces polaires. L’aberration chromatique En optique la distance focale change avec la couleur, c’est à dire avec la longueur d’onde. En microscopie électronique il est de même, les électrons ne sortent pas du canon à la même vitesse. Les plus lents ont un point focal proche de la lentille, les plus rapides auront un point focal plus éloigné. - Les aberrations sphériques - Les aberrations chromatiques - Les comas - Les astigmatismes - Les distorsions - Les aberrations de charge d’espace Préparation de l’échantillon Avant de procéder à l’observation microscopique, il convient d’appliquer divers traitements sur l’échantillon afin d’obtenir une image avec un bon contraste. La préparation de l’échantillon est similaire à celle d’une observation au microscope optique. Toutefois la qualité de la préparation doit être supérieure pour une observation au microscope électronique, un artefact étant beaucoup plus visible. De manière chronologique il convient de: - déshydrater - inclure - couper en coupe extrêmement fine - post-fixation - fixer - contraster La fixation de l’échantillon La fixation consiste à tuer la cellule sans en altérer la structure de façon significative. Elle doit éviter toute déformation et garder l’arrangement cellulaire aussi proche du réel. Il existe deux types de fixation: Fixation chimique Fixation physique La fixation chimique crée des liaisons entre les molécules existantes. Cela consiste à former un pontage chimique, un échafaudage qui va consolider les structures. En microscopie électronique, sont principalement utilisés deux fixateurs: (- le permanganate de potassium (KMnO4)) - le tétroxyde d’osmium (OsO4) - les aldéhydes La fixation de l’échantillon Le permanganate de potassium Très utilisé dans les années 60-70, permet la fixation des lipides et de ce fait préserve bien certaines membranes cellulaires. Cependant, les particules cytoplasmique ayant un contenu élevé en ARN sont mal conservées. De plus, la fixation des chromosomes n’est pas satisfaisante. Le tétroxyde d’osmium Le tétroxyde d’osmium agit sur les doubles liaisons insaturées. Il aura une action ciblée sur la membrane mais aussi sur certaines chaînes latérales des acides aminés (histidine, lysine, cystéine et méthionine) entraînant une gélification des protéines. Lipide insaturé Os O O O O Os O O O O O Os O O O O O Os O O Le tétroxyde d’osmium est un métal lourd qui est également utilisé pour donner du contraste à l’image La fixation de l’échantillon Les aldéhydes Trois différents aldéhydes sont utilisés comme fixateur en microscopie électronique, le formaldéhyde, l’acroléine et le glutaraldéhyde. C H 2 O H H O H H O O H uploads/Science et Technologie/ 2-polycopie-microscopie-electronique.pdf