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Medjaoui chapitre 2 la spectrophotometrie m2 biochimie techniques danalyses

Université Hassiba Benbouali de Chlef SNV Département de Biologie Module Techniques d ? analyses Biochimiques et Moléculaire M CHAPITRE LA SPECTROPHOTOMÉTRIE Présenté par Dr MEDJAOUI I CPlan du cours Introduction Spectroscopie d ? absorption dans l ? UV-Visible La loi de Beer-Lambert Applications de la spectroscopie UV-visible C Introduction ? La spectroscopie ou spectrométrie est le domaine qui étudie la mesure de l'énergie transportée par les rayonnements électromagnétiques ? C ? est un ensemble de méthodes analytiques qui consistent à mesurer l ? absorbance ou la densité optique d ? une substance chimique donnée en solution C Introduction ? La spectrophotométrie est utilisée dans divers domaines chimie pharmacie environnement agroalimentaire biologie etc ? ? La technique de spectrométrie d ? absorption UV-visible est la plus utilisé dans les laboratoires d ? analyses biologiques C Spectroscopie d ? absorption dans l ? UV-Visible ? Spectroscopie d ? absorption dans l ? UV-Visible est basée sur la propriété des molécules d ? absorber des radiations lumineuses de longueur d ? onde déterminée Le spectre électromagnétique C Domaine UV-Visible ? Dans une molécule les transitions électroniques ont lieu dans la région de l ? ultraviolet et du visible ? Le domaine UV-visible s'étend environ de à nm ? Visible nm indigo - nm rouge ? Proche-UV nm - nm ? UV-lointain nm- nm C Domaine UV-Visible Pour les appareils usuels les domaines utiles de longueur d ? onde dans les domaines UV-Visible sont UV nm ? nm Visible nm ? nm C Appareillage Le spectrophotomètre UV-visible est constitué des éléments suivants Source de lumière monochromatique ? Visible Lampe à incandescence à Tungstène et iode ? UV Lampe à arc à Deutérium ou à Xenon ou mercure Monochromateur sélection de la longueur d ? onde ? Prisme ? Réseau Cuve ? Visible Verre ? UV Quartz Détecteur Photomultiplicateur ou photopiles Spectrophotomètre C Principe du spectromètre UV-visible ? Une source de lumière blanche traverse un monochromateur qui sélectionne une radiation de longueur d ? onde ? Le faisceau de lumière monochromatique incident d ? intensité I traverse alors une cuve contenant une solution colorée Un phonocapteur convertit l ? intensité lumineuse transmise I en un signal électrique En ?n un analyseur traite le signal électrique et a ?che la valeur de l ? absorbance Schéma de principe du spectromètre UV-visible C Préréglage d'un spectrophotomètre monofaisceau ? Le choix de la longueur d ? onde de travail On règle le spectrophotomètre à la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorbance de la solution étudiée pour une plus grande précision et une plus grande sensibilité des mesures ? Réglage du blanc Le solvant et le s réactif s utilisés n'étant pas toujours transparents il est obligatoire de réaliser un blanc ? c'est-à-dire une mise à zéro du dispositif tarer en ne plaçant que le solvant et le s réactif s utilisés dans la cuvette avant la mesure de la cuvette contenant l'échantillon et ce pour chaque longueur d'onde étudiée C spectrophotomètre double faisceau Sur un spectrophotomètre double faisceau