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SESSION 2016 1/15 CONCOURS G2E BIOLOGIE Durée : 3 heures Les calculatrices prog

SESSION 2016 1/15 CONCOURS G2E BIOLOGIE Durée : 3 heures Les calculatrices programmables et alphanumériques sont interdites. L’usage de tout ouvrage de référence et de tout document est strictement interdit. Si, au cours de l’épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d’énoncé, il en fait mention dans sa copie et poursuit sa composition. Dans ce cas, il indique clairement la raison des initiatives qu’il est amené à prendre. Les candidats doivent respecter les notations de l’énoncé et préciser, dans chaque cas, la numérotation de la question posée. Une grande attention sera apportée à la clarté de la rédaction et à la présentation des différents schémas. Remarque importante : Les deux parties Biologie 1 et Biologie 2 sont indépendantes. Au sein de chaque partie, les questions suivent une problématique progressive et le jury vous demande donc de les aborder dans l’ordre. BIOLOGIE 1 (durée conseillée 1h30) ÉTUDE DE LA DIVISION CELLULAIRE Partie 1 (3,5 points) EXPRESSION DE LA PROTEINE SCC1 La division cellulaire est un moment clé du cycle cellulaire. Ce phénomène donne naissance à deux cellules-filles dont les caractères sont hérités de la cellule-mère. La répartition correcte du matériel génétique maternel dupliqué est essentielle. Le support expérimental de cette étude est la levure Saccharomyces cerevisiae, qui se divise par bourgeonnement : la rupture du bourgeon concrétise la séparation des deux cellules-filles. 1.1. ADN et chromatides au cours du cycle cellulaire On utilise deux souches de levures : une sauvage et une mutante ne synthétisant pas la protéine SCC1. Le document 1 représente l’évolution des caractéristiques suivantes au cours du temps : bourgeonnement cellulaire, séparation des chromatides et extension du fuseau de division. Les graphes de droite représentent la quantité d’ADN par cellule. Dans deux lots, on utilise du nocodazole qui dépolymérise les microtubules. Question 1.a. Nommer les étapes successives de la mitose et préciser leur fonction en une seule phrase chacune. Question 1.b. D'après le document 1, dans quel mécanisme est impliqué le gène SCC1 ? 1.2. La protéine SCC1 au cours du cycle cellulaire On crée une souche de levure possédant la séquence codante sauvage du gène scc1 associée à un épitope Myc. L'épitope Myc est le domaine de la protéine Myc reconnu spécifiquement par l'anticorps anti-Myc. La protéine SCC1-myc est ainsi aisément détectable par immunofluorescence. Le document 2 décrit l’évolution, au cours du temps la quantité d’ADN par cellule (2-A), la quantité de protéine SCC1-myc (2-B) et la localisation cellulaire de cette protéine, en relation avec l’ADN et les microtubules (2-C). Le temps 0 correspond au transfert dans un milieu complet à 25°C. 2/15 Document 1 : Évolution de caractéristiques cellulaires de deux souches de levures. Document 2 : Évolution des caractéristiques cellulaires de deux souches de levures. Document 2-A : Quantité d’ADN par cellule au cours du temps (en minutes). Document 2B : Électrophorèse d’extraits cellulaires prélevés aux temps indiqués (en minutes), révélée par immunofluorescence. Swi6p est une protéine exprimée durant tout le cycle cellulaire. Document 2-C : Localisation cellulaire chez des levures sauvages de différents composés par des colorants fluorescents spécifiques. DAPI : coloration de l’ADN en bleu. Tub : coloration de la protéine tubuline en vert. Scc1 : coloration de la protéine SCC1 en rouge. Question 2.a. À partir de l’analyse du document 2-A, distinguer les grandes phases du cycle cellulaire. Question 2.b. Formuler une hypothèse sur la fonction de la protéine SCC1 grâce aux analyses des documents 2-B et 2-C. 3/15 1.3. Rôle de la protéine SCC1 On construit une nouvelle souche de levure exprimant une protéine SCC1 non dégradable. Après trois jours de culture, la souche sauvage et la souche mutante sont mises en contact avec de la colchicine, alcaloïde végétal qui dépolymérise les microtubules. Les cellules cultivées sont alors toutes au même stade de division : la métaphase. Afin de localiser la chromatine, les souches expriment une histone modifiée : l’histone H2-GFP correspond à la fusion de la protéine histone H2 avec la protéine fluorescente verte GFP. Document 3 : Évolution du matériel génétique au cours du temps, observée par fluorescence Le temps (heure:minutes) est indiqué en bas à gauche de chaque photo. Question 3. Analyser le document 3 afin de conclure sur le rôle de la protéine SCC1 dans la division cellulaire. 4/15 Partie 2 (3,5 points) DEVENIR DE LA PROTEINE SCC1 On cherche à comprendre comment la séparation des chromatides est déclenchée lors de la division cellulaire. 2.1. Intervention de la protéine ESP-1 On utilise une souche sauvage de cellules humaines, exprimant des protéines homologues de celles étudiées chez S. cerevisiae. On constitue deux lots : un lot témoin sans modification et un lot test où l’on injecte un ARN interférent d’ESP-1. Document 4 : Photographies de mitoses. A, B et C: Cellules sauvages. Les deux flèches en C pointent le sillon de division. D, E et F: Cellules avec ARNi. Les deux flèches en F pointent des ponts de chromatine de deux cellules interphasiques. La barre d’échelle mesure 20 µm. Question 4. Analyser le document 4 afin de déterminer le rôle de la protéine ESP-1. 5/15 On construit une souche de S. cerevisiae exprimant une protéine chimère sous le contrôle du promoteur de l’opéron galactose. De l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale, cette protéine chimère est la fusion d'un épitope FLAG, de la protéine ESP-1 et d'un domaine de liaison à la chitine CBD. L'épitope FLAG est reconnu spécifiquement par un anticorps anti-FLAG. Cette souche exprimant FLAG-ESP-1-CBD sera utilisée dans les documents 5 et 6. On utilise deux cultures de la souche construite de S. cerevisiae, l’une en présence de galactose, l’autre non. Les protéines cellulaires totales ou les protéines retenues sur une colonne de chromatographie d’affinité à billes recouvertes de chitine sont purifiées à partir de chaque culture puis on effectue une électrophorèse et un transfert sur membrane (= Western blot). Les protéines fixées à la membrane sont révélées comme indiqué sur le document 5. Document 5 : Western blot des protéines de la souche exprimant la protéine chimère FLAG- ESP-1-CBD en présence ou en absence de galactose. Question 5.a. Expliquer le principe de la technique de chromatographie utilisée pour obtenir les résultats du document 5. Question 5.b. Analyser le document 5. 6/15 2.2. Action de la protéine ESP-1 sur SCC1 On utilise la souche exprimant FLAG-ESP-1-CBD. Les protéines cellulaires totales sont extraites et passent sur une colonne de chromatographie d’affinité à billes recouvertes de chitine. On fait ensuite passer la protéine SCC1 sur cette colonne. L’éluat récupéré est analysé par Western blot et on révèle la protéine SCC1 par un anticorps spécifique anti-SCC1. Les résultats sont présentés sur le document 6-A. Le document 6-B présente les résultats d’un Western blot révélant la protéine SCC1 par un anticorps spécifique anti-SCC1. Avant la migration, la protéine a été incubée en présence de diverses substances extraites de cellules en métaphase de mitose, comme indiqué sur le document. La protéine ESP-1 est membre d’une famille protéique possédant un domaine catalytique conservé nommé CD Clan. On utilise des concentrations croissantes (0-1 mM) de la molécule cmk, un inhibiteur spécifique du domaine CD Clan sur la protéine ESP-1. La protéine ESP-1 mutante n’est pas fonctionnelle. Document 6 : Western blot de la protéine SCC1 après incubation avec divers composants cellulaires. Question 6.a. Proposer une hypothèse à partir de l’analyse du document 6-A. Question 6.b. Analyser le document 6-B et déterminer la fonction de la protéine ESP-1. Question 6.c. Conclure, en trois lignes maximum, sur l’intervention de la protéine ESP-1 grâce à l’analyse de l’ensemble des documents de la partie 2. 7/15 Partie 3 (3 points) REGULATION DE LA DIVISION CELLULAIRE À partir d’une souche sauvage de S. cerevisiae bloquée en métaphase, on extrait et purifie les protéines SCC1, ESP-1 et Pds1. On élabore différents milieux réactionnels contenant la protéine SCC1 et les molécules indiquées sur les pistes du document 7 ci-dessous. Après incubation durant 30 minutes à 37°C, on réalise ensuite une électrophorèse et un transfert sur membrane. La protéine SCC1 est ensuite révélée immunologiquement. Les résultats sont présentés sur le document 7. Document 7 : Dosages in vitro de l’action des protéines ESP-1 et Pds1 sur la protéine SCC1 - : absence du composé ; + : présence du composé. Question 7. Analyser le document 7 afin de proposer une condition nécessaire à l’activité de la protéine ESP-1. On utilise la même souche que pour le document 7. Le milieu réactionnel est différent puisqu’il contient des quantités décroissantes de protéine ESP-1. L’ADN d’un plasmide générique est aussi présent dans une partie des puits (+). La protéine SCC1 est révélée par un anticorps anti-SCC1. Les résultats sont présentés sur le document 8. Les variations apparentes de masse sont dues à un artéfact de migration. Document 8 : Dosages in vitro de l’activité de la protéine ESP-1 sur la protéine SCC1. - : absence d’ADN plasmidique ; + : présence d’ADN plasmidique. Question 8.a. Analyser le document 8 afin de proposer une condition nécessaire à l’activité de la protéine ESP-1. Question 8.b. Sous la forme d’un schéma, représenter la régulation de uploads/s1/biologie-2016.pdf