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Introduction : Techniques d’isolement Pour étudier les microorganismes, il est

Introduction : Techniques d’isolement Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilisées : La méthode des stries La méthode des dilutions 1- Méthode des stries :  Cas d'un ensemencement en surface à partir d'un prélèvement liquide ou solide : -Prendre les précautions habituelles pour un ensemencement (N’ouvrir que le temps nécessaire à l'exécution des stries et n'entrebâiller alors la boite que devant un bec Bunsen) -porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone stérile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture (solide) ou le tube (liquide) -prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge - ensemencer de la façon suivante : -Partir de 1 en ensemençant selon le sens des flèches jusque vers 2. Flamber l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction précédente 1-2 jusque vers 3. -les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer après 24 à 48heures selon le cas (la position renversée permet à l'eau de condensation de S’évaporer Résultats obtenus : Après l’incubation à 30 °C 2- Méthode des dilutions : Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide : Cette technique permet, après un étalement sur milieu solide, d'évaluer le nombre de colonies par ml de suspension. Elle peut permettre également, si l'on ne dispose pas de lame à numération, la détermination du nombre de cellules par unité de volume ou du nombre de cellules présentes dans une colonie. -Les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un liquide physiologique de type Ringer -Numéroter des tubes à essai de 1 à 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de dilution -Dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois fois - homogénéiser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prélever 0.1 ml et verser dans le tube 2. Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la dilutionn°10. Méthode autre : f tlf +photo Isolement des souches 2. Purification des souches Après 24h d’incubation, les cultures sont purifiées. Celle-ci qui permet d’obtenir des cultures pures à partir de souches obtenues. La sélection est basée sur l’aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le diamètre, l’opacité… Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé ensuite purifié par repiquage successif selon la méthode de stries (Austin, 1988). 3. Conservation des souches Les souches isolées sont conservées dans des tubes à essai contenant un milieu GN incliné (annexe 2). Les souches sont ensemencées sur la pente des tubes par la méthode des stries, puis incubées à 30°C pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu u ne croissanceseront conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines. Afin de pouvoir toujours disposer de souches viables, la réactivation doit se faire tous les mois (Marchal et Bourdon, 1982) 4. Identification des souches purifiées L’identification des isolats est basée sur leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques (Coloration de Gram, détermination de la te mpératured’incubation, catalase, croissance dans NaCl, croissance en anaérobiose, test de Voges-Proskauer et de rouge de Méthyle, Croissance à pH 5.7, la fermentation des carbohydrates,l’hydrolyse de l’amidon, utilisation du citrate, la formation d’indole, formation du dihydroxyacetone, déamination du phénylalanine, hydrolyse de caséine, dégradation detyrosine, hydrolyse de gélatine, jaune d'œuf lécithines) et sur les systèmes d’identification rapides Etude des caractères morphologique Cette étude est basée sur des observations macroscopiques et microscopiques (x100) permettant de différencier le type de Gram, les coques, les bacilles ainsi que la disposition des cellules. . 1. 1. Examen macroscopique L’observation de l’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l’identification. D’après les auteurs Thoma et al . (1970), les éléments d’identification macroscopiques sont : -La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.- -La taille des colonies par la mesure du diamètre : pinctiformes ou non pinctiformes.- -La chromogènes : couleur de la colonie. -L’élévation : convexe, concave, plate. -L’opacité : opaque, translucide ou transparente. -La surface : lisse, rugueuse, sèche, dentelée,…etc . 1. 2. Aspect microscopique Observation à l’état frais Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation se fait sur mic roscope photonique. a) 1. Mode opératoire -Déposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre. -Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas déborder les contours de la lamelle).-Luter la lame avec de la paraffine fondue.-Observer immédiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relevé au maximum (diaphragme non complètement ouvert). -Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel. a) 2. Observation au microscope Elle se fait en lumière blanche, éclairage direct de la préparation (grossissement : objectif x40) . 1. 2. 2. Techniques de coloration simple : bleu de méthylèneb) 1. Technique -Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche : avec une anse on étale doucement un peu de suspension bactérienne sur le milieu de la lame.-Sécher.-Fixer à l’alcool et rincer à l’eau, ou fixer à la flamme en passant la lame trois fois dans la flamme du bec Bunsen réglé en flamme éclairante (virole fermée).-Recouvrir d’une solution de bleu de méthylène pendant une minute. Rincer et sécher entre deux papiers-filtres. Eliminer l’humidité résiduelle au-dessus de la veilleuse du bec Bunsen Introduction de tt les TP : La microbiologie est une sous-discipline de la biologie consacrée à l'étude des micro-organismes. Autrement dit c’est la science ayant pour objet l’étude des microbes (micros : petit, bios : vie) .Ce terme englobe sans distinction tous les micro-organismes vivants.Les micro- organismes constituent un monde, fait d’unités cellulaires vivantes, vastes et complexes. Cette considération est due au lien entre ces êtres vivants et les maladies. Le développement de visualisation a permis de connaître les données structurelles, métaboliques et les diverses actions de ces micro-organismes. Dans nos séances de travaux pratiques, On a essayé d’appliquer et déterminer quelques importantes opérations pour pouvoir mieux comprendre la microbiologie :La première séance a eu comme grand titre : la mise en évidence de le présence des micro-organismes dans différentes biotopes, puis dans la deuxième séance on a vu les différentes Techniques d’ensemencement et d’isolements, dans la troisième on a établit l À coloration Gram et dans les quatrièmes et cinquièmes séances, On a bien fait une analyse d’eau. En suite de notre rapport on va essayer de bien développer et expliquer toutes ses expériences et établir les différents résultats de chacune de ces opérations. uploads/s3/ isoloment.pdf