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ETSL 95 rue du Dessous des Berges 75013 Paris BTS BIOPHYSICIENS ETSL 2014/2015

ETSL 95 rue du Dessous des Berges 75013 Paris BTS BIOPHYSICIENS ETSL 2014/2015 TRAVAUX PRATIQUES de BIOCHIMIE PROTOCOLES et COMPTE RENDUS C. SAUNIER C. SAUNIER 2biophysiciens version 2014-2015 page 2/71 Table des matières TP n° 1 : Le FER ................................................................................................................................. 3 Protocole et compte rendu ........................................................................................................... 7 TP N°2 : Les PROTEINES ............................................................................................................. 11 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 14 TP N° 3 : PHOSPHATES et CHOLESTEROL ............................................................................. 24 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 26 TP N° 4 : LA BETAGALACTOSIDASE ......................................................................................... 32 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 34 TP N° 5 : L’ACIDE URIQUE ........................................................................................................... 39 TP n° 6 : DOSAGES DE L’ASPARTATE, DE L’ASPARAGINE ET DE L’ACIDE GLUTAMIQUE ................................................................................................................................. 42 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 43 TP N° 7 : DOSAGES du GLUCOSE, du FRUCTOSE et du SACCHAROSE ............................ 51 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 55 TP n° 8 : REVISIONS GENERALES ............................................................................................. 64 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 65 C. SAUNIER 2biophysiciens version 2014-2015 TP 1 : Le FER page 3/71 TP n° 1 : Le FER Le fer, est un élément chimique, de symbole Fe et de numéro atomique 26. C'est le métal de transition et le matériau ferromagnétique le plus courant dans la vie quotidienne, sous forme pure ou d'alliages. Le fer pur est un métal mou (davantage encore que l'aluminium), mais l'adjonction de faibles quantités d'éléments d'additions (quelques pourcents) le rend considérablement plus dur. Allié au carbone et avec d'autres éléments d'additions, il forme les aciers dont certains peuvent être mille fois plus durs que le fer pur. Propriétés chimiques principales 1. Oxydation du métal Le fer, combiné à l'oxygène, s'oxyde, suivant les conditions en trois oxydes de fer : • l'oxyde de fer (II) FeO (« oxyde ferreux »), • l'oxyde de fer (III) Fe2O3 (« oxyde ferrique »), • l'oxyde de fer (II, III) Fe3O4 (« oxyde magnétique »). À l'air libre en présence d'humidité, il se corrode en formant de la rouille. 2. Les ions du fer en solution aqueuse En solution aqueuse, l’élément chimique fer est présent sous forme ionique avec deux valences principales : • Fe2+ (l'ion fer (II), anciennement appelé ferreux) : suivant l'environnement chimique en solution, il peut prendre différentes couleurs. La solution obtenue par dissolution de sel de Mohr, par exemple, présente une couleur vert pâle. Une telle solution est stable pour les pH inférieurs à 6. Pour un pH supérieur à cette valeur, l'hydroxyde de fer (II) Fe (OH)2 précipite ; • Fe3+ (l'ion fer (III), anciennement appelé ferrique) : les solutions de chlorure de fer (III) sont oranges, et celle de nitrate de fer (III) sont incolores. Ces solutions doivent avoir un pH inférieur à 2 car l'hydroxyde de fer (III) Fe (OH)3 est peu soluble. 3. Oxydoréduction des ions du fer L'oxydoréduction est une manière de titrer les ions fer (II), par exemple par les ions cérium (IV) (couple Ce4+/Ce3+) ou par les ions permanganate MnO4 - (couple MnO4 - / Mn2+ en milieu acide sulfurique). 4. Complexation des ions fer De nombreux complexes du fer en solution aqueuse se forment facilement, par simple addition du ligand (au bon pH). Parmi les complexes les plus courants se trouvent ceux impliquant les ligands : • ion cyanure CN- : o pour Fe (II) : Fe (CN)6 3-, ion hexacyanoferrate (II), jaune ; o pour Fe (III) : Fe (CN)6 2-, ion hexacyanoferrate (III), orange ; Ces complexes permettent de préparer le bleu de Prusse. C. SAUNIER 2biophysiciens version 2014-2015 TP 1 : Le FER page 4/71 • ion fluorure F- : en chimie analytique, ce complexe permet de marquer la couleur des ions fer (III). • 1,10-phénantroline (o-phen en abrégé) pour Fe (II) : Fe(ophen)3 2+, rouge, ions triorphophénantrolinefer(II) pour Fe (III) : Fe(ophen)3 3+, vert, ions triorphophénantrolinefer(III) Le couple redox constitué de ces deux complexes est utilisé comme indicateur de titrage d'oxydoréduction. • ions thiocyanate SCN- : pour Fe (III) : Fe (SCN)2+, rouge sang, ion thiocyanatofer (III) ; Ce complexe permet de mettre en évidence de petite quantité d'ion fer (III) en solution grâce à sa couleur caractéristique. Rôles et utilisation 1. Complexe bioinorganique : L'hémoglobine du sang est une métalloprotéine constituée d'un complexe du fer (II). Ce complexe permet aux globules rouges de transporter le dioxygène des poumons aux cellules du corps. La solubilité du dioxygène dans le sang est en effet insuffisante pour alimenter efficacement les cellules. Ce complexe est constitué d'un cation Fer (III) complexé par les quatre atomes d'azote d'une porphyrine et par l'azote d'un résidu histidine appartenant à la chaîne protéique. Le sixième site de complexation du fer est soit vacant, soit occupé par une molécule de dioxygène. Il est notable que le fer (II) fixe une molécule de dioxygène sans être oxydé. Cela est dû à l’encombrement du fer par la protéine. 2. Composant de l’acier : Le fer n'est pratiquement pas utilisé à l'état pur (hormis pour résoudre certains problèmes de soudabilité, notamment sur aciers inoxydables). C'est le principal élément entrant dans la composition de l'acier. Le fer métallique et ses oxydes sont utilisés depuis des décennies pour fixer des informations analogiques ou numériques sur des supports appropriés (bandes magnétiques, cassettes audio et vidéo, disquettes). L'usage de ces matériaux est cependant désormais supplanté par des composés possédant une meilleure permittivité, par exemple dans les disques durs. 3. Dans l'alimentation Le fer est un oligo-élément et fait partie des sels minéraux indispensables qu'on retrouve dans les aliments, mais peut être toxique sous certaines formes. On le retrouve dans la bière, le vin blanc ou rouge…. 4. En pharmacie Le fer est utilisé pour la préparation de médicaments. Du XVIIe siècle au début du XXe siècle, il était l'un des principaux composants des boules d'acier vulnéraires, boules de Nancy, boules de Molsheim, boules minérales des Chartreux, qu'on faisait tremper dans de l'eau pour la charger en substances réputées bénéfiques. Importance biologique Le fer est essentiel au transport de l'oxygène et à la formation des globules rouges dans le sang. Il est un constituant essentiel des mitochondries, puisqu'il entre dans la composition de C. SAUNIER 2biophysiciens version 2014-2015 TP 1 : Le FER page 5/71 l’hème du cytochrome C. Il joue aussi un rôle dans la fabrication de nouvelles cellules, d'hormones et de neurotransmetteurs. Absorption Le fer contenu dans les végétaux (fer dit « non héminique ») Fe3+ ou fer ferrique est moins bien absorbé par l'organisme que celui contenu dans les aliments crus d'origine animale (fer « héminique ») Fe2+ ou fer ferreux. La cuisson des viandes transforme une partie du fer héminique en fer non héminique, moins biodisponible. Toutefois, l'absorption du fer est favorisée si on le consomme avec certains nutriments, comme la vitamine C ou le jus de citron1. En revanche son absorption est inhibée par la consommation de thé et/ou de café car les tanins (polyphénols) sont des chélateurs de fer. Les buveurs de thé en très grande quantité ont donc parfois des anémies ferriprives. Proportion et Toxicité L'accumulation de fer dans l'organisme entraîne la mort cellulaire. Des chercheurs de l'INSERM suspectent, à cause de cela, que l'excès de fer pourrait être impliqué dans la dégénérescence des neurones chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Une carence en fer est source d'anémie et peut affecter le développement cognitif et socio- émotionnel du cerveau de l'enfant ou exacerber les effets de certaines intoxications (saturnisme par exemple). Pour la femme en ménopause et l’homme adulte, les apports journaliers recommandés de fer sont de 10 mg ; ce besoin nutritionnel est de 16 à 18 mg pour la femme de sa puberté à la ménopause. Questions préliminaires Première Partie : DETERMINATION de la LONGUEUR d’ONDE OPTIMALE • Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 7 tubes s’étalant régulièrement de 0 à 30 µg/tube à partir d’une solution de fer II à 20 mg.L-1. Le volume final de chaque tube est de 10 mL. Comment allez-vous procéder pour réaliser vos tubes étalon (dilution de l’étalon, volumes d’étalon à prélever) o Dilution de l’étalon (formule littérale, application numérique et matériel utilisé) o Volumes d’étalon à prélever (exemple de calcul pour le tube coloré 4) • Explicitez votre critère de décision pour le choix de la longueur d’onde de travail. 1 Mettre du jus de citron sur ses aliments est donc une excellente habitude culinaire si l'on manque de fer ; par contre, un complément en vitamine C est inutile si l'on ne souffre pas de carence en vitamine C (la carence extrême est le scorbut), même si cela ne peut pas mener à une hypervitaminose puisque la vitamine C est hydrosoluble (et donc son surplus s'élimine par la sudation et la voie urinaire). C. SAUNIER 2biophysiciens version 2014-2015 TP 1 : Le FER page 6/71 Deuxième partie : DOSAGE d’une SOLUTION de FER par la METHODE à l’ORTHOPHENANTROLINE • Votre solution inconnue est comprise entre 6,00 à 12,0 mg.L-1. Afin de la doser, il est nécessaire de la diluer avant de l’utiliser. Comment allez-vous procéder ? (formule littérale, application numérique et matériel utilisé) • La limite de uploads/s3/ protocoles-et-cr.pdf