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Faculté de médecine d’Alger ImmuNo Doctr Ilias 1 Doctr Ilias méthode immunoch

Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 1 Doctr Ilias méthode immunochimiques Ce sont toutes les méthodes se basant sur la mise en évidence du complexe qui se forme lors de la réaction Ag – Ac Ces techniques sont utilisées pour détecter et éventuellement quantifier, soit des antigènes, soit des anticorps Introduction Interaction Ag-Ac Caractéristiques très rapide, de l’ordre de quelques secondes, réversible (LIAISONS NON COVALENTES) de faible énerg Ag+Ac complex Ag-Ac ; la loi d’action de masse est respecté la constante K = k1/k2 permet de définir l’affinité d’un anticorps pour son antigène Quatre types de forces sont mises en jeu (plus forte à la plus faible) : 1)forces électrostatiques (ioniques) 2)liaisons hydrogènes3)Liaisons hydrophobes4)forces de Van der WAALS On mesure l'affinité d'un anticorps pour son antigène, par la mesure de la somme des forces attractives et répulsives La spécificité de la réaction est due à la complémentarité structurale. Elle est très élevée mais pas absolue Si l’antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité. Si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex …); les complexes immuns forment un agglutinat Facteurs influencent PH Modifie l’état d’ionisation des groupements de l’antigène et de l’anticorps Température Augmentation de l’affinité avec augmentation de la température Forces ioniques Diminution des liaisons Ag-Ac avec l’augmentation des forces ioniques Application Détection et dosage de l'Ag Détection et titrage de l'Ac Il existe de nombreuse techniques permettant de détecter les Ag ou AcLe choix de la technique est fonctionné de différents paramètres:-la concentration de l’Agou Ac-la forme de l’antigène (soluble ou particulaire) Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 2 Doctr Ilias Réactions de PrécipiTations Technique de précipitation Antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité. Observation directe des effets de la réaction Ag-AC (visible à l’œil nu) Les réactions se déroulent en trois étapes : Liaison de l’Ac au déterminant antigéniques Formation d’un réseau par réarrangement des sites de liaison Agrégation des réseau et formation de précipité visible à l’œil nu Caractéristiques : Ag: soluble Ac: précipitine ou Ac polyclonaux Réseau tridimensionnel (zone d’équivalence) Lecture : - œil nu - turbidimétrie, néphélémétrie Méthode de Précipitation en milieu HEIDELBERGER Précipitation milieu LIQUIDE & GELIFIE KENDALL Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 3 Doctr Ilias I)Méthode de HEIDELBERGER et KENDALL Notion de courbe de précipitation : La zone d'équivalence (est le point où la courbe atteint son maximum) correspond à la formation d'un réseau Ag-Ac II)Précipitation en milieu liquide Test de l'anneau (ring test) Néphélémétrie Turbidimétrie C'est un test qualitatif On introduit dans un tube des antigènes et des anticorps et on laisse reposer. Ils vont lentement diffuser dans le milieu, créant des gradients de concentration. Lorsqu'ils sont à l'équivalence, c'est-à-dire qu'il y a autant de paratopes que d'épitopes, ils forment des complexes et précipitent Applications: Vérification après chaque injection D’allo-imunisation chez l’animal pour s’assurer d’en être dans la bon voie Un rayon laser traverse le tube contenant d’éventuelles précipité Ac/Ag La diffraction de la lumière par les précipité Ac/Ag (nephelos = nuage) est mesurée à la sortie Plus il y a de précipité Ac/Ag, plus il y aura de signal sur le photomultiplicateur (appareil qui mesure la diffraction) La mesure, rapide et automatisée, permet un dosage quantitatif. Cette technique permet aussi des mesures d'agglutinats Mesure de l’intensité du faisceau directement transmis en éliminant la lumière diffusée dans la même direction Avantage: Réalisé sur un simple spectrophotomètre Inconvenant: Concentration relativement élevé de réactif Application: dosage α1microglobuline, CRP, Albumine, transferrine, haptoglobine, β2 microglobuline, les apoprotéine, LDL-chol, PPS, PPR ,PPU Photometrie des milieux troubles Néphélémetrie laser P0 = Pa + Pt + Pr P0: énergie incidente Pa: énergie absorbée Pt: énergie transmise Pr: énergie réfléchie LASER (Light Amplification by Stimulated Emission Piège à lumière of Radiation) Emetteur de lumière monochromatique dans le visible ou l’infrarouge cohérente,,possédant une intensité élevée & susceptible d’être concentrée en un réseau très fin Avantage: La consommation de réactif est inferieur à celle de la turbidimétrie Application: doser toutes les proteines dans les liquides biologiques Ig, complément, facteur rhumatoïde, PPS, PPR, PPU. Sensibilité: 0.5g/l Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 4 Doctr Ilias III)Précipitation En milieu gélifié Diffusion des réactants dans un milieu gélifie gradient de concentration A la zone d’équivalence formation d’un précipite Diffusion simple Diffusion pulsé par un champ électrique Caractéristiques des gels 1.Inertes chimiquement 2.Visqueux à 50°C ce qui permet d’inclure Ag et Ac sans qu’ils soient dénaturés 3.Solides à 37°C 4.Transparents, permettant l’observation des précipités TEST D’OUCHTERLONY Diffusion double Immunodiffusion double Technique qualitative Si les solutions d’Ag ou d’Ac sont complexes Plusieurs arcs de précipitation But : Analyse qualitative des solutions d’Ag ou d’Ac Étude des relations entre différents Ag Technique de Mancini Diffusion simple Immunodiffusion radiale Principe: technique d’immunoprécipitation quantitative qui consiste en la diffusion passive et radiale de la protéine à doser au sein d’un gel incorporé d’immun sérum spécifique de cette protéine & formation de cercle de précipitation aux zone d’équivalence Le diamètre du cercle est proportionnel à la concentration de la protéine L’utilisation d’étalon de concentration connues permet d’établir une courbe d’étalonnage Application :Le dosage des protéines (ex. faire le profil protéique sérique) inconvénient : devoir attendre au moins 18 heures pour que le précipité se forme, de plus la précision de la méthode est faible Sensibilité: 50mg/l Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 5 Doctr Ilias ELECTRO-IMMUNO-QUANTIFICATION DE LAURELL OU ELECTROPHORESE EN FUSEE (ROCKET) Diffusion simple immunoélectrophorèse en fusées Proche de la technique de Mancini, la diffusion de l'antigène est accélérée par un champ électrique Le gel est incorporé La migration se fait dans une seule direction, et le précipité ressemble à une fusée (rocket) ou à une flamme La hauteur du précipité est proportionnelle à la concentration de l'antigène La mesure de cette concentration se fait par extrapolation à partir d’une courbe d’étalonnage Application: Des facteurs de la coagulation sont dosés par cette méthode dosage des protéines: (ex. faire le profil protéique sérique) Le résultat est accessible en quelques heures ELECTROIMMUNO QUANTIFICATION (LAURELL) Gel contenant un Immun-sérum mono spécifique résultat quantitatif est obtenu en 4 heures Contre-immuno Electrophorèse ou Electro synérèse Principe: technique qualitative d’immunoprécipitation en gel vierge ou la diffusion de l’Ag et de l’Ac est accélérée par un courant électrique (CE) Support: gel d’agarose à fort effet d’électro-endosmose (EEE) Ag et Ac migrent rapidement à la rencontre l'un de l'autre Au niveau des zones d'équivalence, la réaction Ag-Ac conduit à la formation d'un arc de précipitation Applications: Cette technique a été proposée au début pour la détection de l'Ag associé à l'hépatite B (Ag HBs) ou celle des Ac correspondants (marqueurs de l’hépatite-B), ainsi que pour la mise en évidence d'auto-Ac spécifiques de différents Ag solubles du noyau recherche d’auto anticorps anti- antigènes nucléaires solubles (SSA, SSB, Sm, RNP…) Immuno Electrophorèse Solutions antigéniques trop complexes Techniques en deux temps Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par propriétés indépendantes, leur mobilité électrophorétique et leur spécificité antigénique Dans un premier temps, les molécules antigéniques sont séparées grâce à leur différence de mobilité dans un champ électrique Dans un deuxième temps, lorsque la séparation est jugée suffisante, un antisérum est placé dans une rigole parallèle au sens de migration des Ag Ag et Ac diffusent librement dans le gel et donnent des arcs (lignes) de précipitation selon le même principe que l'immunodiffusion d'Ouchterlony Cette technique est hautement discriminative et a permis la mise en évidence de plus de 30 molécules antigéniques différentes dans le sérum humain en utilisant comme Ac un sérum animal antisérum humain Applications: elle se prête à une étude semi-quantitative des concentrations d'Ag et permet l’identification d’un composant monoclonal (préciser la classe et la sous classe des Ig monoclonales en cas d’immunoglobulinopathies monoclonales) Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 6 Doctr Ilias Immunofixation Principe: technique immunochimique qualitative en deux temps: 1.séparation électrophorétique 2.Immunoprécipitation par des immun-sérums mono spécifiques suivit d’une coloration Application: mettre en évidence la nature et de préciser le typage d'une immunoglobuline monoclonale (myélome…) décelés à l’électrophorèse des protéines sériques/urinaires Méthode plus sensible & plus rapide que l'immunoélectrophorèse Immunoselection Principe: varient d’immunielectrophorese Cette technique permet la détection de chaînes lourdes libres présentes en faible quantité dans des liquides biologiques Les chaînes lourdes libres vont migrer et pourront être identifiés dans un second temps par immunodiffusion en utilisant un immun sérum spécifique Le gel est incorporé d’anti-chaînes légères Kappa et Lambda en quantité optimale, ces Ac précipiteront les Ig entières sous forme de « rockets » ou obus Application: Recherche de la maladie des chaines lourdes aloha le plus souvent Rarement gamma ou mu Réactions D’agglutinaTion *L’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex…) *Les complexes immuns forment un agglutinat *Observation directe des effets de la réaction Ag-AC (visible à l’œil nu) *L’agglutination est utilisée comme un test qualitatif de la présence d’anticorps dans le sérum sanguin et pour déterminer le groupe sanguin Faculté de médecine d’Alger *ImmuNo* Doctr Ilias 7 Doctr Ilias Réactions d’agglutination Le Principe Les Paramètres uploads/Finance/ 2-reaction-precipitation-et-agglutination.pdf