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pg. 1 4- Méthodes de dosage et mesure de l’activité enzymatique Beaucoup de dos

pg. 1 4- Méthodes de dosage et mesure de l’activité enzymatique Beaucoup de dosages, notamment biologiques, reposent sur des techniques enzymatiques. Deux cas de ﬁgure peuvent se présenter : - Dosage d’une molécule qui est utilisée en tant que substrat. - Détermination de l’activité d’une enzyme. I. Determination de la concentration d’un substrat Il existe deux cas de ﬁgure : - Méthode point ﬁnal : transformation du substrat en un produit P qui lui va être quantiﬁable. Dans ce cas là, la réaction doit se dérouler le plus rapidement possible, doit être totale et en général la concentration en substrat doit préférablement être faible. - Méthode cinétique : travail en vitesse de réaction. Il est préférable que la vitesse de réaction soit lente et la concentration en substrat élevée. 1. Méthode point final Le but de cette méthode est de transformer la totalité du substrat en produit. Le problème est que toute réaction possède un équilibre S1+ S2= P1+ P2. La constante d’équilibre des réactions est : Ke = [P1][P2] / [S1][S2]. Pour que la concentration en produit final soit égale à la concentration en substrat initial, il faut que la réaction soit la plus complète possible. Pour rendre une réaction totale, on peut : - Piéger un des produits pour inciter la consommation du substrat. - Augmenter la concentration de S2 pour les mêmes raisons. - Coupler la réaction avec une réaction secondaire qui va permettre de consommer un des produits. ❖ Dosage en mesure directe : La première réaction donne un produit coloré. Exemple : CH3-CH2OH + NAD+⇌ CH3-CH=O + NADH,H+ L’acétaldéhyde peut être piégé par semi-carbozène. NAD et NADH n’ont pas du tout les mêmes propriétés spectrales, ce qui permet le dosage. pg. 2 En travaillant à 340 nm, une fois que la réaction est totale, il sufﬁt de mesurer l’absorbance du milieu réactionnel. Par la loi de Beer-Lambert (A=εlc) et connaissant l’absorbance, on peut retrouver la concentration du NADH produit. Comme la réaction est totale, cette concentration correspond également à la concentration en substrat (éthanol) initial. ❖ Dosage à l’aide d’une réaction couplée : Par exemple, pour le dosage du glucose, la réaction utilisée est la suivante : Fig: Dosage à l’aide d’une réaction couplée (détection du glucose à partir de NADH) (See pdf: Enzymatic Food Analysis) Le dosage est fait de façon indirecte, à l’aide d’une deuxième réaction. On obtient le résultat en travaillant à 340 nm et en dosant le taux de NADH final. 2. Méthode cinétique Avec cette méthode, on étudie la vitesse de réaction, c’est à dire la quantité de produit formé en fonction du temps. pg. 3 La vitesse suit l’équation de Michaelis et Menten : Lorsque la concentration en substrat est largement inférieure au Km, elle est négligeable, et alors Vi = k x [S] (avec k = Vmax/Km) II. Méthodes de détection Il existe 2 types de détection : - Les méthodes nécessitant la séparation du substrat et du produit. - Les méthodes ne nécessitant pas la séparation du substrat et du produit 1. Méthodes nécessitant la séparation du substrat et du produit ❖ Spectrophotométrie d’absorption : En termes de spectrophotométrie, on peut travailler soit dans l’UV (200-350 nm), soit dans le visible (350-700 nm). Cette méthode repose sur la loi de Beer-Lambert. Quand le faisceau lumineux Io, traverse un milieu, il en résulte un faisceau d’intensité It. Si It = Io, alors la solution n’absorbe pas. Cette absorbance est proportionnelle au ε de la molécule à la longueur d’onde donnée, et est proportionnelle à la concentration de la molécule. pg. 4 ❖ Spectroﬂuorimétrie : On mesure la ﬂuorescence à 90° (car à 180° il y aurait une pollution du signal par It, qui est beaucoup plus puissant). ❖ Titrage acide-base : Il n’est utilisable que lorsque l’un des produits est un acide ou une base. La formation d’acide fait diminuer le pH. A l’aide d’une base forte (NaOH), on rétablit le pH initial. Le nombre de molécules ajoutées correspond alors au nombre d’esthers esthériﬁés. Cette méthode est appelée méthode du pH stabilisé. ❖ Manomètrie : Elle peut être utilisée pour déterminer l’activité enzymatique lorsque la réaction produit ou consomme un gaz. 2. Méthodes ne nécessitant pas la séparation du substrat et du produit Il existe plusieurs techniques permettant de séparer le substrat du produit. ❖ La chromatographie sur couche mince : Elle ne permet qu’une analyse qualitative mais permet tout de même d’avoir une idée de l’avancement de la réaction. Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur polarité : - les molécules polaires restent sur la silice (hydrophile) - les molécules apolaires avancent avec le solvant (hydrophobe) On peut ainsi faire des CCM tout au long de la réaction, en arrêtant la réaction en modiﬁant le pH par exemple. ❖ La chromatographie liquide haute performance (HPLC) : Elle fonctionne sur le même principe que la CCM mais est plus rapide et plus précise. Sa reproductibilité est sans faille ❖ La chromatographie en phase gazeuse (CPG) : pg. 5 De la même façon que pour la CCM et l’HPLC, les molécules sont séparées en fonction de leur polarité, mais l’échantillon passe cette fois dans une colonne et est propulsée par un gaz inerte au lieu d’un liquide (helium, azote…). On obtient alors des chromatographes. De façon classique (dans 90% des cas), il faut au moins 4 à 5 cinétiques différentes, avec 4 à 5 concentrations en substrat différentes. Il existe encore d’autres techniques qui permettent de déterminer l’activité enzymatique mais elles sont moins utilisées (radioactivité, immunologie en test ELISA…). III. Mesure de l’activité catalytique des enzymes La mesure de l’activité catalytique des enzymes est l’étude de la vitesse de réaction. Cette vitesse de réaction est déterminée dans des conditions physico-chimiques précises (force ionique, pH, température...). La vitesse de réaction est toujours proportionnelle à la quantité d’enzyme, quelle que soit la concentration en substrat. Cette vitesse dépend de la concentration en substrat uniquement si la concentration en enzyme est constante. Elle atteint son maximum Vmax à partir d’une certaine concentration en substrat. 1. L’activité enzymatique Au début du XXème siècle, il existe plusieurs unités pour l’activité enzymatique: Bolanski, Bessey. En 1961, les chercheurs décident de créer une unité internationale, qui correspond au nombre de µmol de substrat utilisé par minute. En 1966, la Catal apparait, il correspond au nombre de mol utilisées par seconde. En 1972, il est renommé Katal. 2. L’activité spéciﬁque AS = AE / masse de protéines Pour 8 mol d’enzyme : - Si l’enzyme est pure, AS = AE/8 - Si l’enzyme est contaminée par 2 mols de protéines, AS = AE/10 Ainsi, l’activité spéciﬁque est le reﬂet de la pureté de l’enzyme. pg. 6 5- Démonstration de l'équation de Michaelis et Menten. Détermination graphique de vmax et KM 1. Les enzymes michaeliennes Les enzymes sont des catalyseurs biologiques, c’est-à-dire des molécules capables d’accélérer des réactions chimiques spécifiques et qui sont retrouvées dans leur état initial à l’issue de la réaction catalysée. Il existe différents mécanismes enzymatiques selon l’enzyme considérée. Les enzymes dites michaeliennes fonctionnent selon le mode suivant : un substrat S se lie avec une enzyme E pour donner un intermédiaire ES, appelé complexe enzyme-substrat, puis cet intermédiaire se dissocie pour donner un produit P avec régénération de l’enzyme E. Précision importante : chaque site actif se comporte indépendamment des autres, qu’ils soient physiquement séparés (un site actif par molécule) ou non (plusieurs sites actifs par molécule). Bien entendu, il existe bien d’autres mécanismes enzymatiques. Citons en particulier les enzymes allostériques qui possèdent nécessairement plus d’un site actif par molécule (au moins deux) et pour lesquelles les caractéristiques cinétiques d’un site actif vont varier en fonction de l’état des autres sites de la même molécule (liés ou non liés à un substrat). Chaque mécanisme se traduit par des caractéristiques cinétiques spécifiques (évolution de la vitesse de catalyse au cours du temps). Pour faire une étude cinétique, il faut mesurer la vitesse instantanée de la réaction à différents moments en ayant choisi avec soin les conditions initiales. À partir des mesures on peut tracer des courbes représentant la cinétique de la réaction, ce qui permet de déterminer certaines valeurs caractéristiques. L’équation de Michaelis-Menten est une expression mathématique décrivant les paramètres cinétiques d’une réaction chimique catalysée par une enzyme michaelienne. 2. Détermination de l’équation de Michaelis-Menten Au début du XXe siècle, Michaelis et Menten ont proposé un mécanisme réactionnel pour la transformation d’un substrat S en un produit P par une enzyme E. Ce mécanisme comporte deux étapes et fait intervenir un intermédiaire réactionnel : le complexe enzyme-substrat, noté ES. k1 k2 E+S⇌ ES ⇌ E+P k−1 k−2 Avec k1, k−1, k2 et k−2 sont les constantes de vitesse des différents actes élémentaires. pg. 7 Rappel de cinétique chimique : les concentrations des espèces à l'instant t sont notées [E], [ES], [S] et [P]. Les concentrations initiales de ces espèces sont notées [E]0, [ES]0, [S]0 et [P]0. La vitesse de réaction (caractérisée par la vitesse d’apparition du produit, soit v=d[P]/dt) varie avec le uploads/Finance/ ch-4-5-methodes-de-dosage-et-mesure-de-lactivite-enzymatique.pdf