Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

DIAGNOSTIQUE DE L’ADH L’Hormone antidiuretique ( ADH) ou Aginine vasopressine s

DIAGNOSTIQUE DE L’ADH L’Hormone antidiuretique ( ADH) ou Aginine vasopressine se dose par les techniques de RadioImmunilogique (RIA) I- Prinicipe générale sur la RIA La methode radioimmunologique a été créée il a 12 ans par YALOW et BERSON. Actuellement, elle connait une extension considerable et est appliquéennon seulement au dosage de tres nombreuses hormones protéiques et polpeptiques mais aussi à des enzymes et meme à des molecules déprourvues de propriétes antigéniques propres tells les steroids. Deux grandes techniques sont actuellement utilisées: l’une est basée sur les antigens marqués. L’autre sur les anticorps marqués. 1- La technique originale de BERSON reste encore la plus générale. Elle est basée sur la competition entre un antigène marqué Ag* (radioactive) et un antigène non marqué Ag pour un anticorps spécifique Ab. Ag* + Ag + Ab Ag* Ab + Ag Ab Si l’antigène marqué est ajouté en quantité constante ainsi que l’anticorps, l’antigène non marqué déterminera la quantité d’antigène marqué liée aux anticorps. Le Rapport sera d’autant plus faible que la quantité d’hormone non marquee ajoutée au milieu d’incubation sera plus élevée. Pour réaliser un dosage, il faut donc d’abord établir une courbe standard en portant en ordonnée l’activité du complexe Ag* Ab et en abscisse la quantité progressivement croissante d’antigène non marquee ajoutée au milieu d’incubation. Lorsque la solution d’antigène non marquee est remplacée par un serum ou un milieu biologuqe don’t on desire connaitre le tau xen antigène, il suffit de déduire de la courbe, la concentration en antigène correspondant à l’activité du complexe Ag* Ab mesurée dans ce cas (YALOW, R.S.; BERSON, S. A, 1960). II- Diagnostique proprement dite (marque IDia source) II-1 principe Vasopressin RIA Après extraction en phase solide (SPE) ou extraction à l'éthanol des échantillons de plasma, la vasopressine est dosée par un dosage radio-immunologique compétitif. La vasopressine urinaire peut être mesuré directement. Ce test utilise un antisérum de lapin anti-vasopressine et un traceur vasopressine [125I] radio-iodé. Les phases liées et libres sont séparées par un second anticorps lié à des particules en phase solide, suivi d'une étape de centrifugation. La radioactivité dans les fractions liées est mesurée et une courbe d'étalonnage typique peut être généré. Les valeurs des échantillons extraits sont corrigées pour extraction. II-2 Matériels Ag* Ab Ag* Pipettes (100 µL, 200 µL, 300 µL, 1 mL, 2 mL, 5 mL) Distributeurs à répétition (100 µL, 200 µL) Cylindre de mesure 25 mL Tubes RIA en polystyrène (12 x 75 mm) Absolu d'éthanol (99 %) Vortex Centrifugeuse Bain De Glace Vac-concentrateur Gaz azoté Tubes en polystyrène ou en verre pour extraction (16 x 100 mm) Sep-pak C18 Acide acétique 4% Méthanol absolu (99 %) 1 N HCl III-CONDITION DE PRELEVEMENT Une normalization soignée de la preparation des échantillions et des conditions d’échantillonnage est recommandée. le sang totale est prélévé dans un tube EDTA ou de l’héparine chez un sujet à jeun. Puis centrifuge à 4°C pour séparer le plasma. Congélé l’echantillion dans des cryotubes à – 20°C Jusqu’au dosage. Et la vasopressine est stable à - 20°C jusqu’au dosage pendant quatre semaines, ou stable jusqu’à 3 mois après l’ajout de 500 KUI d’aprotinine ; après extraction la vasopressine est stable à -20°C pendant 6 mois. Dans l’urine, la vasopressine peut etre determine directement dans l’urine humain non extraite. Recuire l’urine sur 24h et enregistrez le volume d’urine. Si l’échantillion n’est pas dosé immédiatement, conserver un aliquotage à – 20°C. IV- PRÉPARATION DU RÉACTIF PRÉPARER TOUS LES RÉACTIFS 15 MINUTES AVANT L'UTILISATION ! A. Anti-vasopressine : Reconstituer avec 22 mL d'eau distillée. Mélanger délicatement. Conserver à -20 °C pendant au moins 3 mois après la reconstitution. B 125I- vasopressine : Reconstituer avec 25 mL d'eau distillée. Mélanger délicatement. Conserver à -20 °C jusqu'à la date d'expiration. C. Double phase solide des anticorps : Prêt à l'emploi. Le réactif de séparation devrait être placé sur un agitateur magnétique pendant 10 minutes à température ambiante (18-25°C). Conserver à 2-8°C jusqu'à la date d'expiration. Il est possible de pipeter le réactif avec un distributeur à répétition. D. Tampon d'essai : Prêt à l'emploi. Conserver à 2-8°C jusqu'à la date d'expiration. E. Calibrateur : Reconstituer à l'eau distillée par le volume indiqué sur le flacon étiquette. Mélanger délicatement. Conserver à -20 °C pendant au moins 3 mois après la reconstitution. Voir le tableau de la section X. B pour la préparation de la courbe d'étalonnage. F. Contrôles : Reconstituer avec 2 mL d'eau distillée. Mélanger délicatement. Magasin à - 20 °C pendant au moins 3 mois après la reconstitution. La valeur des contrôles est V-PROCÉDURE V-1 ETRACTION DE L’ECHANTILLION Avant de procéder à la procédure RIA, deux méthodes différentes de préparation des échantillons peuvent être utilisées : A1 : extraction Sep-pakC18 et A2 : extraction à l'éthanol A1 : procédure d'extraction Sep-pakC18 Colonne : cartouche Sep-pakC18 NB: NE PAS EXTRAIRE LE CALIBRATEUR DE CONTROL. 1- Laver la colonne avec 10 ml d'eau distillée, 5 ml de méthanol et 10 ml d'eau distillée, respectivement. 2- Acidifier un échantillon de plasma de 1 mL avec 150 µL1NHCl. 3- Apportez cet échantillon acidifié dans la colonne. 4- Laver la colonne avec 20 ml d'acide acétique à 4 %. 5- Éluez avec 4 ml de méthanol. 6- Sécher le méthanol sous courant d'azote ou d'air. 7- Reconstituer le résidu avec 1 ml de tampon buffer. 8- Suivez le manuel RIA régulier. Pour estimer la récupération, ajouter une aliquote (200 L) de traceur 125I-vasopressine à un échantillon de plasma aléatoire et soumettre l'échantillon de récupération pour la même procédure d'extraction. Calcul de récupération a/. Préparez un tube d'estimation de récupération (R). - Pipeter 1 ml d'un échantillon de plasma aléatoire dans le tube de récupération (R). L'échantillon utilisé pour ce test de récupération doit avoir une matrice protéique similaire aux échantillons testés. - Ajouter 200 µL de 125I-vasopress dans le tube (R) et mélanger. - Extrayez cet échantillon avec les échantillons de la procédure ci-dessus. b/. Préparez un tube de récupération totale (TR). -Pipette 200 µL 125I-vasopressintracer dans deux tubes de récupérations (TR). - Ajouter 100 µL bufferandmix. c/. Reconstituer l'échantillon séché (R) en ajoutant 1 ml de tampon de dosage et vortex soigneusement. d/. Pipeter 300 µL du tube d'échantillon de récupération reconstitué (R) dans deux tubes. e/. Comptez les tubes de récupération totale (TR) et de récupération (R) pendant au moins deux minutes dans un compteur gamma. Calculez le pourcentage de récupération en divisant les cpm dans les tubes de récupération (R) par les cpm dans les tubes de récupération totale (TR) et en multipliant par 3,33 : % de récupération : cpmRecoverytube(R) x 3,33 / 100 % cpm. A2 : procédure d'extraction à l'éthanol NB: NE PAS ÉTALONNAGE ET CONTRLES DE TEXTRAC. 1- Étiquetez un tube d'extraction pour chaque échantillon. Étiqueter un tube supplémentaire afin d'estimer la récupération par extraction. 2- Placer les tubes d'extraction et l'éthanolonice. 3- Pipeter 0,8 ml d'échantillon dans les tubes d'extraction étiquetés de manière appropriée. 4- Préparez un tube d'estimation de récupération (R).  Pipeter 0,8 ml d'un échantillon de plasma aléatoire dans le tube de récupération (R). L'échantillon utilisé pour ce test de récupération doit avoir une matrice protéique similaire aux échantillons testés.  Ajouter 200 µL 125I-vasopressintracer dans le tube(R) et mélanger.  Extrayez cet échantillon avec les échantillons à l'étape 6. 5- Préparez un tube de récupération totale (TR).  Pipette 200 µL 125I-vasopressintracerintotwoTotalRecoverytubes (TR).  100 µL bufferandmix.  Recapichonnez puis mettez de côté ces tubes à prendre en compte pour le calcul de récupération. 6- Ajouter 4 ml d'éthanol réfrigéré à chaque échantillon et tube de récupération (R). 7- Mélanger et vortexer pendant 2 minutes. 8- Centrifuger tous les tubes d'extraction (échantillons et R) à 2000g.pendant 15min.à4°C. 9- Décanter le surnageant de chaque tube d'extraction dans des tubes de 16x100mm préalablement préparés et propres. 10- Evaporer les surnageants sous courant d'azote à sec (à max.37°C), ou évaporer à l'aide d'un concentrateur Vac. 11- Reconstituer les échantillons séchés en ajoutant 0,8 m de tampon d'essai et en vortexant le texte à fond. 12- Procédez immédiatement à la procédure RIA ou stockez les échantillons extraits à - 20°C jusqu'à deux semaines avant de les utiliser dans le test. 13- Reconstituer l'échantillon de récupération séché (R) en ajoutant 0,8 ml de tampon d'essai et vortex soigneusement. 14- Pipeter 300 µL du tube d'échantillon de récupération reconstitué (R) dans deux tubes à essai. 15- Comptez les tubes de récupération totale (TR) et de tubes de récupération (R) pendant au moins deux minutes dans un compteur gamma. Calcul de recuperation Calculez le pourcentage de récupération en divisant les cpm dans les tubes de récupération (R) par les cpm dans les tubes de récupération totale (TR) et en multipliant par 2,67 : B- Realisation du courbe d’etallonage Dilution Calibrateur de vasopressin Concentration de vasopressin 60 pmol/L 1000 µL calibrateur a vasopressin + 1000 µL buffer Calibrateur b 30 pmol/L 1000 µL calibrateur b vasopressin + 1000 µL buffer Calibrateur c 15 pmol/L 1000 µL calibrateur c vasopressin + 1000 µL buffer Calibrateur d 7.5 pmol/L 1000 µL calibrateur d uploads/Finance/ diagnostique-de-adh.pdf