Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

Méthodes d’analyse de l’interaction des protéines et acides nucléiques Introduc

Méthodes d’analyse de l’interaction des protéines et acides nucléiques Introduction répresseur Séquence protéique Opérateur Codon stop Codon start Promoteur ARN Polymérase Inducteur répresseur Séquence protéique Opérateur Codon stop Codon start Promoteur ARN Polymérase A B Les régions régulatrices de l’activation des gènes: l’expression des gènes est régulée par un ensemble de facteurs activateurs et inhibiteurs de la transcription. L’interaction de ces facteurs (protéines) avec l’ADN est site spécifique. Introduction Objectif: Présentation de quelques techniques permettant l’étude des interactions entre protéines et ADNs. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) Cette technique sert à l’identification des sites de liaison des protéines régulatrices sur la molécule d’ADN génomique. Permet de déterminer les positions exactes de liaison des protéines à l’ADN génomique. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ADN Protéines liant l’ADN xxx xxx xxx xxx Crosslink (1% paraformaldehyde) Fragmentation de l’ADN par sonication xxx xxx xxx xxx Fragments ~200 nucléotides 1 2 Etapes de la méthode Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) xxx xxx xxx xxx Fragments ~200 nucléotides Précipitation de l’ADN liant la protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique xxx xxx xxx xxx Reverse cross-link (incubation O.N. à 65°C) xxx xxx Purification des fragments d’ADN xxx xxx PCR, séquençage des fragments 3 4 5 Etapes de la méthode Consiste à construire un vecteur rapporteur contenant un gène rapporteur sous la dépendance d’un promoteur constitué d’une séquence régulatrice. La technique des gènes rapporteurs Gènes rapporteurs: C’est une technique qui permet la détection ou la mesure de l’intensité de l’expression d’un gène. Les gènes rapporteurs peuvent correspondre à des protéines fluorescentes ou bien des enzymes capable de convertir des substrats invisibles vers des produits luninescents ou bien colorés. Analyse de l’expression du gène rapporteur Principe: Transfection de cellules Vecteur rapporteur La technique des gènes rapporteurs Promoteur (fluorescence, luninescence…) Exemple: Luc Luciférase, b-Gal: b Galactosidase, GFP…etc. Le gène rapporteur: Le gène rapporteur est un gène témoin codant pour une protéine facilement détectable et quantifiable (émission de fluorescence ou de luminescence). Il est largement utilisé pour étudier et déterminer les activités des régions promotrices de divers gènes. La technique des gènes rapporteurs La technique des gènes rapporteurs Etudier le rôle des interactions protéines ADN dans la régulation spatio-temporelle de l’expression génique: Déterminer le compartiment cellulaire abritant l’expression et l’activité du gène (noyau, cytosol, surface cellulaire…etc.). Caractériser les séquences régulatrices qui contrôlent l’expression du gène étudié. Le gène rapporteur code pour une protéine révélatrice de la présence de l’interaction entre une protéine régulatrice avec une ou plusieurs séquences promotrices étudiées. La technique des gènes rapporteurs 1- Amplification de la région promotrice à étudiée (région régulatrice). 4- Mesure et analyse de l’expression du gène rapporteur dépendante du promoteur. 3- Transfection des cellules eucaryotes/procaryotes et expression du gène rapporteur après induction du promoteur. 2- Insertion de la séquence de la région promotrice dans un vecteur rapporteur contenant le gène rapporteur. Les étapes de la technique: promoteur Gène de la Luciférase Gène rapporteur Séquence étudiée Stimulant Activation Luciférase Luciférine + ATP + O2 Oxyluciférine + AMP + PPi + CO2 + Mg2+ Lumière - Luc + Luc Luciole: firefly La technique des gènes rapporteurs Exemple-1 : Le gène Luc codant pour la Luciférase qui émet de la lumière jaune. Exemples de gènes rapporteur: +H2O Hydrolyse par la b- galactosidase Oxydation et dimérisation spontanées X-gal galactose 5-bromo-4-chloro-3-hydorxyindole 5,5’ –dibromo-4, 4’-dichloro-indigo (produit insoluble de couleur bleue) Exemple2: Le gène b-Gal codant pour la Galactosidase qui transforme X gal en Galactose et émission d’une couleur bleue La technique des gènes rapporteurs Exemple3 : Le gène GFP codant pour la Green fluorescent protéine qui possède une fluorescence verte. La technique des gènes rapporteurs Quelques exemples de gènes rapporteur: La création de protéines de fusion par fusion de la séquence du gène d’intérêt à la séquence de la GFP (ou protéines dérivés) permet l’étiquetage de la protéine d’intérêt afin d’accéder à sa localisation instantanée dans les cellules vivantes. Clones bactériens exprimant la GFP Méduse Imagerie sur cellules vivantes La technique des gènes rapporteurs GFP mCherry Transport antérograde t=0 s t=7 s t=15 s t=23 s Méthodes d’analyse de l’interaction des facteurs de transcription avec l’ADN par la technique : Empreinte à la Dnase I Empreinte à la Dnase I L’empreinte à la Dnase I est une technique simple, sert à la détermination des sites de liaison d’une protéine (facteur de transcription) sur l’ADN. Permet de déterminer la taille approximative du site d’interaction, de quantifier le nombre de sites d’interaction entre un fragment ADN avec une protéine régulatrice. L’interaction des facteurs de transcription avec l’ADN est séquence spécifique. Empreinte à la Dnase I Étapes de la méthode: 1- Amplification de la région régulatrice à étudier (100-300 pb). 6- Southern Blot et révélation par autoradiographie. 5- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide. 4- Digestion partielle à la DNase I de telle sorte à avoir 1 site de coupure par brin. 3- Interaction séquence promotrice et la protéine à analysé. 2- Marquage radioactif p32 sur une extrémité d’un des deux brins ADN. Empreinte à la Dnase I 1 brin marqué au P32 Protéine (FT) Digestion Dnase I Digestion Dnase I Fragments générés marqués au P32 Fragments générés marqués au P32 Gel d’électrophorèse Contrôle Empreinte à la Dnase I Protéine (µg/ml) 0 2 6 8 empreinte Empreinte-1 Empreinte-2 Empreinte à la Dnase I Cas de 2 sites de fixation: Empreinte-1 Empreinte-2 Empreinte à la Dnase I Applications: Détection de protéines fixant l’ADN. Analyse des séquences d’ADN au niveau des promoteurs et régions régulatrices. Détection de protéines liant l’ADN à partir des extraits cellulaire. La technique: Retard sur gel = Electro Mobility Shift Assay (EMSA) C’est une technique in vitro qui permet de mettre en évidence la formation d’un complexe entre une séquence ADN et une protéine. Elle est basée sur l’électrophorèse de ce complexe sur un gel de poly- acrylamide dans des conditions non-dénaturante. La technique : Retard sur gel Étapes de la méthode: 4- Southern Blot et révélation par autoradiographie, ou bien lecture du gel avec un lecteur de fluorescence. 3- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide avec conditions non- dénaturantes. 2- Incubation du fragment ADN avec un extrait de protéines nucléaires. Pour le contrôle de l’expérience, un fragment d’ADN seul est incubé dans le tampon. 1- Marquage du fragment d’ADN double brin (appelé sonde). Le marquage peut être radioactif ou fluorescent. NF-B Sonde seule Extraits nucléaires des cellules non-activées Extraits nucléaires des cellules activées La technique : Retard sur gel Sonde + Exemple de Résultat : - + La technique : Retard sur gel La liaison du facteur de transcription à la séquence ADN induit un retard dans la migration de la bande d’ADN pendant l’électrophorèse. NF-B ? Sonde seule Extraits nucléaires des cellules non-activées Extraits nucléaires des cellules activées (expression génique) Sonde + - + La technique : super Retard sur gel Extraits nucléaires des cellules activées Extraits nucléaire des cellules activées + un anticorps anti-FT NF-B Sonde seule NF-B + anti NF-B Sonde + Sonde + - + + Extraits nucléaires des cellules non- activées uploads/Finance/ empreinte-dnase-gene-raporter.pdf