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Module : Méthodologie scientifiques et techniques d’étude du vivant Niveau : 2

Module : Méthodologie scientifiques et techniques d’étude du vivant Niveau : 2 année licence écologie et BTV. Chapitre 2 : II- METHODES D'ETUDE DE LA COMPOSITION BIOCHIMIQUE DES CELLULES Ces méthodes visent à étudier la nature et la localisation des composants biochimiques de la cellule. 1. Les matériels cellulaires 1.1 Cellules entière ou des coupes de cellules Pour les coupes cellulaires ou bien l’étude de la cellule entière, il faut voir le chapitre 1 partie 2 (préparation des échantillons pour observation microscopique). 1.2 Broyats cellulaires= Homogénats cellulaires * broyat cellulaire = homogénat cellulaire c’est de faire une préparation homogène d'un corps à étudier, il peut être une suspension de cellules, ou bien des fragments de tissu. *Homogénat cellulaire = organites en suspension + débris cellulaires (fragments d'ultrastructures) + constituants biochimiques en solution. *Afin de préparer un homogénat cellulaire, différentes techniques sont utilisables : Ces techniques peuvent être combinées pour une meilleure efficacité. 1- Mortier + abrasif (عملية سحق النسيج (: Cette méthode s'adresse à des fragments de tissus. Les morceaux de tissu sont très souvent congelés immédiatement par immersion dans de l'azote liquide (- 196°C) ou de la carboglace (CO2 liquide, - 80 °C) afin de les durcir. L'abrasif utilisé est généralement le sable de Fontainebleau de granulométrie régulière et très fine. 2- Mixeur (photo ci-dessous) : (Figure 1) Exemple : Le disperseur ultra-Turrax C'est un appareil homogénéisateur. Figure 1 : Le disperseur ultra-Turrax 3- Broyeur Potter-Elvehjem (Figure 2) Il est constitué d'un tube de verre et d'un piston en plastique tels que l'espace annulaire entre le piston et la paroi du tube ne soit que de quelques dixièmes de mm. Le piston tourne à 1000 ou 2000 tours/min et en même temps que le piston tourne, on fait aller et venir le tube verticalement. Les cellules qui passent entre le piston et la paroi du tube sont alors soumises à des forces de cisaillement qui amènent leur éclatement. Figure 2 : Broyeur Potter-Elvehjem 4- Le choc osmotique : On met les cellules dans un milieu hypotonique. Le milieu intracellulaire étant plus concentré qu'à l'extérieur, de cette manière l'eau entre à l'intérieur des cellules sous l'effet de l'osmose. Le volume cellulaire augmentant, la membrane plasmique n'y résiste pas et la cellule éclate. Si les cellules sont délimitées par une paroi, celle-ci peut protéger les cellules de la lyse. Pour éliminer la paroi, on doit placer les cellules dans une solution isotonique tamponnée contenant des enzymes capables d'hydrolyser les constituants de la paroi. ex : cellulases et pectinases pour les cellules végétales. ex : lysozyme pour les cellules bactériennes. ex : chitinase pour levures et moisissures. 5- Vibrateur ultrasonique : Cet appareil émet des ultrasons dont on peut régler la fréquence et l'intensité selon le type des cellules étudiés. On travaille entre 0-4°C, afin d’arrêter tout les activistes enzymatique. En effet la composition cellulaire n'est pas entièrement conservée. La préparation d'homogénats cellulaires est donc réalisée en chambre froide ou dans un bain de glace pilée. 1.3. Fractions cellulaires Si l'on veut étudier la composition biochimique des organites cellulaires, il faut les isoler séparément. La séparation des organites passe par l'obtention de fractions cellulaires. On parle de techniques de fractionnement cellulaire = isolement d'organites cellulaires. 1.3.1 Etapes 2.1. Prélèvement d’une suspension cellulaire ou tissu. 2.2. Homogénéisation : c’est de faire libéré le contenue cellulaire, par la destruction de la membrane plasmique. Quatre procédés sont fréquemment utilisés : a. fractionnement par des ultrasons à haute fréquence b. utilisation d’un détergent doux pour faire des trous dans la membrane plasmique c. forcer les cellules à passer à travers un petit trou en utilisant une forte pression d. saisir les cellules, entre un broyeur tournant étroitement adapté et les parois épaisses d’un récipient en verre. 2.3. Récupération de l’homogénat cellulaire : qui contient les organites cellulaires, les grosses et les petites molécules (enzymes, ribosomes et métabolites). * Principe de la séparation des organites cellulaires : Le fractionnement cellulaire est basé sur la différence de densité des organites. À partir d'un homogénat cellulaire on peut constater que la vitesse de sédimentation des organites, et est différente car leur densité diffère : - les plus denses sédimentent les premiers - les moins denses sédimentent par la suite. 1.4. L'ultracentrifugation différentielle : C’est la séparation des composants de l’homogénat cellulaire en fonction de la taille et de la densité de ses composants. Cette technique est basée sur la centrifugation répétée à des vitesses progressivement croissantes qui peuvent fractionner les homogénats cellulaires en leurs composants initiales (organites, particules et molécules) (figure 3). Les centrifugations doivent être réalisés en milieu refroidi et on doit donc disposer d'une ; ultracentrifugeuse réfrigérée. Pratiquement la technique consiste à soumettre un homogénat de tissu à des centrifugations successives de plus en plus rapides. La vitesse et les temps de centrifugation sont à adapter en fonction de la nature du matériel biologique étudié. Figure 3 : Les étapes de l’ultracentrifugation différentielle. 1.5 L'ultracentrifugation sur gradient de densité : La centrifugation en gradient de densité permet une séparation complète des organites. Pour cela, on doit mettre dans le tube des solutions de saccharose dont la concentration molaire augmente du haut vers le bas (gradient), puis on étale en une fine couche la fraction à purifier sur la dernière solution de saccharose puis on centrifuge. Selon leur densité, les organites migrent vers les zones de saccharose de densité identique (les zones d’où la densité de saccharose et très proche de celle d’organite). Finalement les organites isolés sont récupérés. (Figure 4) Figure 4 : L'ultracentrifugation sur gradient de densité. 2. Les méthodes d'analyse et de dosage biochimiques 2.1 Chromatographie La chromatographie (du grec ancien χρῶμα / khrôma, « couleur » et γράφειν / graphein, « écrire ») est une méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse).. Cette technique est basée sur le taux de solubilité différentielle des composés dans des solvants ou des mélanges de solvants variés. Chaque molécule chimique se déplace à une vitesse propre qui dépendant de ses caractéristiques. Il existe différents types de chromatographies suivant la méthode de séparation utilisée: d’adsorption, de partage, d’échange d’ions, d'exclusion. Abréviations des 3 grandes familles de chromatographie CPG : chromatographie en phase gazeuse HPLC : chromatographie liquide haute performance CCM : chromatographie sur couche mince Cette méthode d'analyse permet l'identification et le dosage de composés dans un mélange. Elle peut-être couplée à un spectromètre de masse pour l'identification de composés inconnus. Pour l'exploiter pleinement il est important de connaitre les différentes grandeurs de rétention et d'utiliser des colonnes avec une bonne efficacité. La chromatographie permet également d'effectuer des dosages avec une grande précision. Les principales méthodes de dosage sont la normalisation interne, la méthode des ajouts dosés et l'étalonnage interne. L'étalonnage externe peut également être effectué sous certaines conditions. La chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple, est une technique physique de séparation d’un mélange chimique. Pour cela on utilise un éluant: solvant qui monte par capillarité le long du support entraînant ainsi les différentes espèces chimiques. Dans certains cas, le partage se fait plus facilement par chromatographie de partage bidimensionnelle : une première chromatographie dans un premier système de solvants est suivie par une deuxième migration dans un système de solvants différent effectuée sur la plaque préalablement séchée et tournée de 90°. Les constituants du mélange sont répartis sur toute la surface de la plaque et donc mieux séparés qu'après une migration monodimensionnelle. *L’électrophorèse : elle est basée sur les différences de charge électrique. Elles permettent aisément de séparer les sucres simples, les acides aminés, les acides organiques et les acides gras, les nucléotides. C’est aussi une méthode intéressante pour séparer, en présence d'un champ électrique, les centaines ou les milliers d'espèces moléculaires de protéines et d'acides nucléiques constituant les mélanges naturellement rencontrés dans les cellules. *Electrophorèse sur papier Dans l'électrophorèse sur papier, l'échantillon est déposé en un point au milieu d'une bande de papier filtre ou d'acétate de cellulose imbibée de solution tampon. Les extrémités de la bande plongent dans deux réservoirs de tampon séparés dans lesquels sont placées les électrodes. Quand on fait passer un courant continu, les ions de l'échantillon migrent vers les électrodes de signes opposés, à des vitesses différentes pour former, éventuellement, des bandes discrètes. La vitesse de migration d'un ion est influencée, dans une certaine mesure, par ses interactions avec la matrice support, mais elle est essentiellement fonction de sa charge. Lorsque l'électrphorégramme est achevé (en général après quelques), la bande est séchée et les constituants de l'échantillon sont localisés grâce aux mêmes techniques que celles utilisées dans la chromatographie sur papier. En conclusion Les macromolécules cellulaires sont solubilisées en désorganisant les cellules par différents traitements chimiques ou mécaniques tels que les broyeurs. Après lyse des cellules, une purification partielle par centrifugation différentielles permet d'éliminer les débris cellulaires ou d'isoler un composant cellulaire intéressant. Une fois sorties du contexte protecteur de la cellule, les protéines et les autres molécules de la cellule doivent être traitées pour ne pas être uploads/Finance/ module-mst-chapitre-ii-converti.pdf