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HAL Id: pastel-00003240 https://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00003240 Submitted on 26 Feb 2008 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Rôle des produits de la réaction de Maillard dans l’inhibition de l’oxydation enzymatique des phénols et des lipides Sophie Cheriot To cite this version: Sophie Cheriot. Rôle des produits de la réaction de Maillard dans l’inhibition de l’oxydation enzy- matique des phénols et des lipides. Life Sciences [q-bio]. AgroParisTech, 2007. English. NNT : 2007AGPT0041. pastel-00003240 L’Institut des Sciences et Industries du Vivant et de l’Environnement (Agro Paris Tech) est un Grand Etablissement dépendant du Ministère de l’Agriculture et de la Pêche, composé de l’INA PG, de l’ENGREF et de l’ENSIA (décret n° 2006-1592 du 13 décembre 2006) i N° /__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/ THÈSE pour obtenir le grade de Docteur de l’Institut des Sciences et Industries du Vivant et de l’Environnement (Agro Paris Tech) Spécialité : Sciences de l’aliment présentée et soutenue publiquement par Sophie CHERIOT le 11 décembre 2007 ROLE DES PRODUITS DE LA REACTION DE MAILLARD DANS L’INHIBITION DE L’OXYDATION ENZYMATIQUE DES PHENOLS ET DES LIPIDES Directeur de thèse : Jacques NICOLAS Travail réalisé au Cnam, UMR 1211, Chaire de Biochimie Industrielle et Agro-alimentaire, F-75141 Paris Devant le jury : M. Pierre GIAMPAOLI, Professeur, ENSIA Président Mme Claude GENOT, Directrice de recherches, INRA Rapporteur M. Michel GIRARDIN, Professeur, INPL – ENSAIA Rapporteur M. Philippe MORAS, Ingénieur, CTIFL Examinateur M. Jacque NICOLAS, Professeur, Cnam Examinateur Mme Catherine BILLAUD, Ingénieur de recherches, Cnam Invitée i TABLE DES MATIERES Remerciements (et excuses)................................................................................................................v Résumé ..............................................................................................................................................vii Abstract ............................................................................................................................................. viii Liste des figures...................................................................................................................................ix Liste des tableaux...............................................................................................................................xv Liste des équations.......................................................................................................................... xviii Liste des publications et communications..........................................................................................xix Participations à des congrès .........................................................................................................xix Publications....................................................................................................................................xx Liste des abréviations........................................................................................................................xxi Introduction .............................................................................................................................................. 1 Travaux antérieurs................................................................................................................................... 4 1. La réaction de Maillard................................................................................................................ 4 1.1. Découverte et redécouverte de la réaction de Maillard ...................................................... 5 1.2. Chimie de la réaction de Maillard....................................................................................... 6 1.3. Les produits de chauffage du glucose seul et de la cystéine seule.................................. 17 1.4. Formation d’arômes par la réaction de Maillard ............................................................... 20 1.5. Propriétés anti-oxydantes des produits de la réaction de Maillard (PRM)........................ 22 1.6. Effets immunologiques et toxicologiques des produits de la réaction de Maillard (PRM). 29 2. Le brunissement enzymatique des fruits et légumes ................................................................ 33 2.1. Aspects économiques du brunissement enzymatique...................................................... 33 ii 2.2. Rôle physiologique des polyphénoloxydases (PPO)........................................................ 34 2.3. Caractéristiques réactionnelles et structurales des polyphénoloxydases......................... 35 2.4. Prévention du brunissement enzymatique ....................................................................... 43 3. L’oxydation enzymatique des lipides......................................................................................... 53 3.1. Les étapes de l’oxydation aérobie des lipides catalysée par la lipoxygénase (LOX)........ 54 3.2. Le site actif et la spécificité d’oxydation de la LOX........................................................... 55 3.3. La spécificité de substrat de la LOX et les réactions enzymatiques catalysées ............... 59 3.4. Rôles physiologiques de l’oxydation lipidique catalysée par la LOX dans les végétaux... 59 3.5. Effets de l’oxydation enzymatique des lipides dans les aliments...................................... 61 3.6. Prévention de l’oxydation enzymatique des lipides dans les aliments.............................. 64 Objectifs de l’étude ................................................................................................................................ 66 Matériels et méthodes............................................................................................................................ 68 1. Matériel biologique.................................................................................................................... 68 2. Produits chimiques et préparation des produits inhibiteurs....................................................... 69 2.1. Introduction à la méthodologie des plans d’expériences.................................................. 69 2.2. Formation des produits inhibiteurs de l’activité PPO ........................................................ 70 2.3. Préparation des produits dont l’activité mutagène a été testée par le test d’Ames........... 74 2.4. Optimisation de la préparation des PRM inhibiteurs de l’activité LOX.............................. 75 3. Caracterisation des systèmes enzymatiques............................................................................ 78 3.1. Mesure des activités enzymatiques.................................................................................. 78 3.2. Dosage des protéines ...................................................................................................... 81 3.3. Détermination des masses moléculaires.......................................................................... 81 3.4. L’électrophorèse............................................................................................................... 83 4. Méthodes d’extraction et de purification des enzymes.............................................................. 84 4.1. Extraction et purification de la PPO d’aubergine et de pomme ........................................ 84 4.2. Extraction et purification de la PPO de pomme de terre................................................... 84 4.3. Extraction et purification de la lipoxygénase de farine de fève......................................... 86 5. Caracterisation des composés inhibiteurs................................................................................. 88 iii 5.1. Dosage des thiols par la méthode d’Ellman ..................................................................... 88 5.2. Détermination des propriétés spectrales d’échantillons inhibiteurs .................................. 89 5.3. Méthodes chromatographiques appliquées aux composés inhibiteurs ............................ 90 6. Méthodes de mesure du pouvoir antioxydant ........................................................................... 97 6.1. Mesure du pouvoir réducteur et antiradicalaire par le test DPPH° ................................... 97 6.2. Mesure du pouvoir antiradicalaire par le test AAPH° ....................................................... 98 6.3. Mesure du pouvoir chélateur du cuivre en utilisant le tétraméthylmurexide (TMM)........ 100 7. Le test d’Ames pour mesurer l’activité mutagéne et antioxydante des PRM........................... 103 7.1. Les souches bactériennes utilisées................................................................................ 103 7.2. Mesure de la mutagénicité des PRM.............................................................................. 105 8. Mesure de la couleur et application des PRM pour inhiber le brunissement enzymatique...... 109 Résultats et discussion ........................................................................................................................ 110 1. Caractérisation des systèmes enzymatiques.......................................................................... 110 1.1. La PPO de pomme de terre ........................................................................................... 110 1.2. La LOX de farine de fève ............................................................................................... 121 2. Action des PRM et du mélange sur l’activité PPO et le brunissement enzymatique............... 125 2.1. Mesure du pouvoir inhibiteur, dosage des réactants résiduels et du HMF dans les PRM 125 2.2. Etude des composés inhibiteurs dans des mélanges composé carbonylé / cystéine chauffée : formation, stabilité, fractionnement et analyses des produits néoformés.................... 131 2.3. Cinétique d’inhibition des PPO par des mélanges HMF ou furfural / cystéine chauffée – comparaison avec les PRM......................................................................................................... 163 2.4. Propriétés antioxydantes du mélange cystéine chauffée / HMF et des PRM inhibiteurs de l’activité PPO............................................................................................................................... 169 2.5. Propriétés mutagènes du mélange cystéine chauffée / HMF et du PRM comparées à celles des réactifs........................................................................................................................ 173 2.6. Mise en œuvre des PRM et des mélanges pour inhiber le brunissement enzymatique . 180 3. Action des PRM sur l’oxydation enzymatique des lipides ....................................................... 187 3.1. Optimisation de l’inhibition de l’oxydation enzymatique des lipides................................ 187 iv 3.2. Effet direct et cinétique d’inhibition de l’activité LOX de farine de fève par les PRMopt2 . 201 3.3. Mode d’inhibition de l’activité LOX par les PRMopt2 ........................................................ 204 3.4. Stabilité du PRM au cours du stockage dans différentes conditions .............................. 207 Conclusions générales et perspectives................................................................................................ 209 ANNEXES............................................................................................................................................ 215 Annexe 1 : Liste des produits chimiques utilisés.............................................................................. 215 Annexe 2 : Résultats du plan d’expériences à 4 facteurs et 5 niveaux pour l’optimisation de l’inhibition de la LOX de fève par les PRM issus de lysine (chapitre 3 – § 3.1.2.) ............................................ 219 Annexe 3 : Résultats du plan d’expériences à 2 facteurs et 5 niveaux pour l’optimisation du traitement thermique des PRM glucose (0,08 M) – lysine (0,08 M) pH ≈10, en vue de l’inhibition de la LOX de fève (Chapitre 3 § 3.1.3.)................................................................................................................. 220 Bibliographie ........................................................................................................................................ 221 Résumés des publications ................................................................................................................... 241 v Remerciements (et excuses) C’est une habitude que de remercier au début d’un tel travail tous ceux qui, plus ou moins directement, ont contribué à le rendre possible ET agréable. Même si dans mon cas, cette liste peut sembler longue, c’est avec mon enthousiasme le plus vif et le plus sincère que je voudrais rendre mérite à tous ceux qui à leur manière m’ont aidé à mener à bien cette thèse. Je désire alors exprimer ma profonde gratitude : - Au Professeur Jacques NICOLAS pour avoir accepté d’encadrer ce travail depuis le DEA, de m’avoir dirigée patiemment et pour son soutien pendant la rédaction de cette thèse, - Au Professeur Pierre GIAMPAOLI qui m’a honoré en acceptant d’être Président de ce jury, mais également pour tous ses conseils toujours pertinents et ses encouragements. - A Mme Claude GENOT et M. Michel GIRARDIN pour avoir accepté d’évaluer mon travail et d’être rapporteurs de ma thèse. - A M. Philippe MORAS pour avoir accepté d’être examinateur dans ce jury… et pour m’avoir orienté vers la polyphénoloxydase d’aubergine… Je voudrais également exprimer toute ma gratitude envers le Dr. Catherine BILLAUD pour ses conseils particulièrement précieux, sa disponibilité mais surtout pour sa rigueur scientifique qui m’a permis de faire progresser rapidement ce travail et qui, je l’espère a quelque peu déteint sur ma personnalité. Ce fut un plaisir de travailler avec toi ! J’ai eu la chance au cours de ma thèse de pouvoir participer à une mission scientifique de trois mois financée par le COST Action 927. Je remercie vivement le Pr. Karl-Heinz Wagner de m’avoir accueillie dans son département : Ein herlzilches Dankeschön möchte ich an Herrn Prof. Dr. Karl-Heinz WAGNER richten, der mir im Laufe meinder Dissertation stets unterstützend mit fachlichem und persönlichem Rat zur Seite stand. Ich möchte Stephan Pöchtrager für die nette Zusammenarbeit beim zählen der 688 008 Kolonien während meines drei-monatigen Aufenthalts in Wien danken. J’adresse mes chaleureux remerciements aux personnes du département de Sciences de l’Aliment et plus particulièrement à l’équipe CSNAAC, à Mmes Marie-Noëlle MAILLARD et Barbara REGA, à M. Pierre GIAMPAOLI et Mlles Muriel MAIRE et Claire ORDONNAUD qui ont conjugué gentillesse et aide apportée à mon travail lors des expériences uploads/Finance/ r-maillard.pdf