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Empreinte dnase gene raporter

Méthodes d ? analyse de l ? interaction des protéines et acides nucléiques CIntroduction A ARN Polymérase répresseur Opérateur Promoteur Séquence protéique B Inducteur répresseur ARN Polymérase Opérateur Promoteur Séquence protéique CIntroduction Les régions régulatrices de l ? activation des gènes l ? expression des gènes est régulée par un ensemble de facteurs activateurs et inhibiteurs de la transcription L ? interaction de ces facteurs protéines avec l ? ADN est site spéci ?que Objectif Présentation de quelques techniques permettant l ? étude des interactions entre protéines et ADNs CImmunoprécipitation de la chromatine ChIP Cette technique sert à l ? identi ?cation des sites de liaison des protéines régulatrices sur la molécule d ? ADN génomique Permet de déterminer les positions exactes de liaison des protéines à l ? ADN génomique CImmunoprécipitation de la chromatine ChIP Etapes de la méthode Protéines liant l ? ADN ADN Crosslink paraformaldehyde xxx xxx xxx xxx Fragmentation de l ? ADN par sonication xxx xxx xxx xxx Fragments nucléotides CImmunoprécipitation de la chromatine ChIP Etapes de la méthode Fragments nucléotides xxx xxx xxx xxx Précipitation de l ? ADN liant la protéine d ? intérêt avec un anticorps spéci ?que xxx xxx xxx xxx Reverse cross-link incubation O N à C xxx xxx Puri ?cation des fragments d ? ADN xxx PCR xxsxéquençage des fragments CLa technique des gènes rapporteurs Gènes rapporteurs C ? est une technique qui permet la détection ou la mesure de l ? intensité de l ? expression d ? un gène Consiste à construire un vecteur rapporteur contenant un gène rapporteur sous la dépendance d ? un promoteur constitué d ? une séquence régulatrice Les gènes rapporteurs peuvent correspondre à des protéines uorescentes ou bien des enzymes capable de convertir des substrats invisibles vers des produits luninescents ou bien colorés CPrincipe La technique des gènes rapporteurs Transfection de cellules Promoteur Vecteur rapporteur Analyse de l ? expression du gène rapporteur uorescence luninescence ? CLa technique des gènes rapporteurs Le gène rapporteur Le gène rapporteur est un gène témoin codant pour une protéine facilement détectable et quanti ?able émission de uorescence ou de luminescence Il est largement utilisé pour étudier et déterminer les activités des régions promotrices de divers gènes Exemple Luc Luciférase b-Gal b Galactosidase GFP ? etc CLa technique des gènes rapporteurs Le gène rapporteur code pour une protéine révélatrice de la présence de l ? interaction entre une protéine régulatrice avec une ou plusieurs séquences promotrices étudiées Etudier le rôle des interactions protéines ADN dans la régulation spatio-temporelle de l ? expression génique ? Caractériser les séquences régulatrices qui contrôlent l ? expression du gène étudié ? Déterminer le compartiment cellulaire abritant l ? expression et l ? activité du gène noyau cytosol surface cellulaire ? etc CLa technique des gènes rapporteurs Les étapes de la technique - Ampli ?cation de la région promotrice à étudiée région régulatrice - Insertion de la séquence de la région promotrice dans un vecteur rapporteur contenant le gène rapporteur - Transfection