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80 Jam Vol XXIV, N°2 Mars/Avril 2016 ARTICLE ORIGINAL EVALUATION DES PERFORMANC

80 Jam Vol XXIV, N°2 Mars/Avril 2016 ARTICLE ORIGINAL EVALUATION DES PERFORMANCES ANALYTIQUES DU RÉACTIF BIURET. Alloui AS(1,2), Amokrane E(1), Settah A(1), Abadi N(1), Ben- latreche C(1). 1)Laboratoire de Biochimie CHU Constantine. 2)Laboratoire MEDPREVAC. Résumé: Le choix d’une technique et sa validation constitue une préoccupation majeure pour le biologiste dont le souci permanent est de garantir la fiabilité des résultats. Ce travail expérimental, est une évaluation des performances analytiques d’un réactif Biuret destiné au dosage manuel des protides totaux dans notre laboratoire. Nous avons utilisé une gamme de solutions croissantes d’albumine et des contrôles du commerce. Le Biuret éprouvé est proche de celui proposé par Gornall. Le protocole suivi est inspiré du protocole de Validation des Techniques Valtec. La limite haute de linéarité est à 100g/L et l’étalonnage montre une courbe linéaire. La limite de détection est à 1,28g/L et le seuil de quantification à 4,25g/L. Les coefficients de variation (CV) ou de reproductibilité sont infé- rieurs à ceux de la Société Française de Biologie Clinique (SFBC), de même pour la justesse et l’inexactitude dont les valeurs sont inférieures aux limites de la SFBC. Le réactif éprouvé présente d’excellentes performances analytiques en termes de détectabilité, de stabilité, de reproductibilité, de justesse et d’inexactitude sauf pour la limite de linéarité. Cette méthode est introduite dans notre laboratoire comme technique manuelle de dosage des protidémies aux concentrations basses et moyennes. Mots clés: Biuret, Protides totaux, Validation, Performances analytiques, Dosage manuel. Abstract: ANALYTICAL EVALUATION OF THE REAGENT BIURET’S PERFORMANCES. The overall determination of proteins’ plasma concentration is an analysis of first intention. Only the variations of the most abun- dant proteins (albumin and immunoglobulins) have a significant effect on the total concentration. Currently, most labs use for the dosage of serum proteins (or plasma) a colorimetric technique based on the Biuret’s color reaction according to the method deve- loped by Gornall et al. in 1949. We conducted an experimental study in our lab in which we evaluated the analytical performance of Biuret reagent done manually for the determination of the total protein in accordance with the validation protocol recommended by the technical guidelines of VALTEC’s SFBC. The experiment yielded positive results which allow us to argue that this reagent has excellent analytical performance in terms of detectability, the reaction stability, reproducibility, and accuracy and inaccuracy. We can also argue that a linearity limit of only 100g /L leads to the systematic implementation of dilutions at high concentrations. These technical characteristics have encouraged us to introduce this method in our lab’s daily routine as a manual technique for the determination of the dosage total proteins at low and medium concentrations. Key words: Biuret, Total protein, Validation, Analytical performance, Manual dosing. Tirés à part: ALLOUI A.S, Service de Biochimie, C.H.U Constantine. 81 Jam Vol XXIV, N°2 Mars/Avril 2016 ARTICLE ORIGINAL Introduction L e choix d’une technique et sa validation, a toujours constitué une préoccupation majeure pour le biologiste dont le souci permanent est de garantir la fiabilité des résultats, compte tenu des moyens mis à sa disposition [1,2]. Le respect des règles d’assurance qualité des laboratoires oblige à procéder à la validation des techniques en préalable à leur uti- lisation [1,2]. La détermination globale de la concentration plasmatique des protéines est une analyse de première intention. Seules les va- riations des protéines les plus abondantes (albumine, immuno- globulines) ont un effet significatif sur la concentration totale. Le dosage des protéines totales plasmatiques est utilisé pour ap- précier les fonctions hépatique et rénale, le dysfonctionnement du système immunitaire et pour surveiller les maladies métabo- liques et nutritionnelles [3]. Actuellement la majorité des labo- ratoires utilisent pour le dosage des protéines plasmatiques une technique colorimétrique reposant sur la réaction de coloration du biuret d’après la méthode développée par Gornall et al. en 1949 [4]. L’objectif de ce travail etait l’étude des performances analy- tiques d’un réactif Biuret destiné au dosage manuel des protides totaux dans notre laboratoire. Matériel et méthodes 1.Matériel a.Spécimens biologiques Nous avons eu recours à une gamme de 36 solutions d’albu- mine obtenue à partir d’une solution mère à 200g/L préparée à son tour à partir d’albumine bovine cristallisée (Fluka, lot n°Code S13448806) contre de l’eau distillée. Ces solutions étaient de concentrations croissantes: 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 145 et 150 g/L. Nous avons utilisés des spécimens de contrôle du commerce, ExatrolR BIOLABO, à deux niveaux de concentration (niveaux 1 et 2), lots n° 061119E1 et 031115E1 respectivement. b.Réactif et technique Le réactif évalué est un réactif Biuret, prêt à l’emploi, d’un seul lot, proche de celui proposé par Gornall [4]. En milieu alcalin (hydroxyde de sodium) les liaisons peptidiques des protéines réagissent avec les ions cuivriques pour former le complexe du biuret caractéristique rose à violet, présentant un maximum d’absorbance à 540 nm. L’intensité de la coloration dépend du nombre de liaisons peptidiques impliquées. Le protocole opératoire de la méthode éprouvée consiste en l’addition de 20µL de spécimen à 1mL de réactif, puis une incu- bation pendant dix minutes à température ambiante et enfin une lecture contre le blanc réactif. c. Appareillage Cette étude de performance a été réalisée sur un spectrophoto- mètre UV-Visible BIOLABO. 2.Méthodes Le protocole suivi pour cette évaluation est inspiré du protocole de Validation des Techniques Valtec de la Société Française de Biologie Clinique SFBC [2,5]. Nous avons réalisé dans la période allant d’Avril à Mai 2013 au niveau du Laboratoire Central de Biochimie du CHU de Constantine une étude qui consiste en: •Une évaluation du domaine de mesure qui comporte une étude de la linéarité et de l’étalonnage, de la limite de détection ana- lytique, du seuil de quantification et de la sensibilité analytique. •Une évaluation de la stabilité de la réaction. •Une étude de la reproductibilité à partir de résultats obtenus sur les spécimens de contrôles pendant une période de 15 jours. •Une appréciation de la justesse et de l’inexactitude par l’étude de solutions du contrôle interne de la qualité suffisamment ca- ractérisées dans notre laboratoire. 3.Tests statistiques L’exploitation statistique des résultats a été réalisée à l’aide du logiciel Statistica StatSoftR. La droite de régression linéaire et le coefficient de corrélation r ont été utilisés pour l’étude de la corrélation. La limite de 5% (p<0,05) a été fixée comme limite de signifi- cativité. Résultats 1.Domaine de mesure a.Linéarité et étalonnage Nous avons vérifié la limite supérieure annoncée du domaine de mesure (120g/L), puis nous avons étudié l’étalonnage. Ainsi, nous avons dosé en triple les 36 solutions d’albumine dans une même série, puis nous avons calculé les coefficients d’exactitude CE. Ensuite, nous avons tracé la courbe d’étalon- nage et réalisé une corrélation entre les valeurs observées et les valeurs théoriques. Avec une limite de significativité fixée à 5%, nous situons la limite haute de linéarité à 100g/L. L’étalonnage a montré une courbe linéaire à la longueur d’onde de lecture (figure 1) selon l’équation suivante: Protides totaux (g/L)=193,65 A540+0,216 (r=0,9975 ; p<0,05). Figure 1. Courbe d’étalonnage des protides totaux à 540nm sur spectrophotomètre BIOLABO. Figure 2. Corrélation entre les valeurs mesurées Y et les valeurs théoriques X. Absorbance à 540nm Concentration La corrélation entre les valeurs observées Y et les valeurs théo- riques X (figure 2) obéit quant à elle à l’équation suivante: Y= 0,9787 X-0,2965 (r=0,9987 ; p<0,05). Y valeurs observées X valeurs théoriques ALLOUI AS. & Col. 82 Jam Vol XXIV, N°2 Mars/Avril 2016 ARTICLE ORIGINAL b.Limite de détection analytique Nous avons dosé trente fois dans une même série de l’eau dis- tillée de qualité analytique, puis nous avons recueilli les résultats en unités d’absorbance [6]. Après calcul, la limite de détection obtenue était à 1,28g/L. c.Seuil de quantification Après calcul au cours du même précédent protocole [7], le seuil de quantification obtenu était de 4,25g/L. d.Sensibilité analytique Nous avons pris les deux concentrations situées aux 2 bornes du domaine de mesure (5 et 100g/L) [7]. Après calcul, la sensi- bilité obtenue était à 0,050 m Abs/10 g/L. 2.Stabilité de la réaction Nous avons étudié la stabilité de la coloration du complexe en fonction du temps après dosage de plusieurs échantillons de concentration située entre 20 et 100g/l, en mesurant l’absor- bance de la réaction à 540 nm toutes les quinze minutes. Nous avons fixé comme limite de stabilité le temps Ti ne dépassant pas une variation de 5% entre l’absorbance mesurée à T0 et Ti. La coloration, après la fin de la réaction, était stable pendant une heure à température ambiante et à l’abri de la lumière avec une diminution de 2,7% de l’absorbance à 540 nm. 3.Reproductibilité Nous avons analysé chaque échantillon pour chaque niveau de concentration dans quinze séries différentes, en début et en fin de série. Les résultats de l’étude de reproductibilité sont regroupés dans le tableau I. Tableau I. Résultats de l’étude de reproductibilité (n= 30). Tableau II. Résultats de l’étude de la justesse et de l’inexactitude. ET CV CVlimite SFBC Icm Biais uploads/Finance/evalu-perfor-analy-du-biuret 1 .pdf