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Corrigé Exercices PCR – Mars 2020 Frédéric Grosjean Application de la PCR au di

Corrigé Exercices PCR – Mars 2020 Frédéric Grosjean Application de la PCR au diagnostic médical Amplification par PCR d’un bout d’ADN CFTR contenant l’acide amine en position 551. Pour pouvoir analyser la région qui contient l’acide aminé 551 on a amplifié des fragments d’ADN, provenant des deux parents et de leurs trois enfants, à l’aide le da PCR en utilisant les amorces A1 et A2 pour produire le fragment X. (Le fragment X correspond à la région d’ADN contenant la séquence de nucléotide qui code pour l’acide aminé en position 551 ; pour rappel, les acides aminés sont codés au niveau de l’ADN par des groupes de trois nucléotides (CODONs). Le tableau vous indiquant quel CODON code pour quel acide aminé vous est donné à la fin du fichier « Analyse génétique par PCR_2020.pdf » disponible sur MyUnil) A1 : 5’‐TTCCTGATAGTCCTTGCCCTTT‐3’ A2 : 5’-TTCTTTAAATGTTCCATTTTAG-3’ 1) En sachant que l’amorce A1 se lie entre la position 760 et 855 de l’ADN soulignez la région correspondante à l’amorce sur la carte d’ADN de CFTR que vous trouvez en annexe. Une des amorces est l’amorce « sens » et l’autre l’amorce « antisens ». Une des amorces va s’associer au brin codant, l’autre au brin complémentaire de manière à pouvoir amplifier sélectivement le fragment d’ADN d’intérêt qui se trouve entre ces deux amorces. La séquence qui est donnée dans l’annexe 1 est la séquence du CFTR, les numéros indiqués en début et fin de chaque ligne correspondent aux positions des nucléotides dans la séquence du CFTR. La ligne du haut représente les nucléotides sur le brin codant (lecture de 5’ en 3’, de gauche à droite), la ligne en dessous correspond au brin complémentaire (de 3’ en 5’, de gauche à droite). Le premier nucléotide sur le brin codant est un « A », le deuxième également, le troisième est un « T », et ainsi de suite… celui en position 2679 est un C. L’amorce A1 est l’amorce sens, elle va s’apparier au brin complémentaire, la séquence à trouver est donc la séquence sur le brin codant (5’ -> 3’) qui correspond à la séquence de l’amorce. 2) En sachant que l’amorce A2 se lie entre la position 1900 et 1995 de l’ADN soulignez la région correspondante à l’amorce sur la carte d’ADN de CFTR que vous trouvez en annexe. L’amorce A2 est l’amorce « antisens », elle est donc complémentaire au brin codant. La lecture du bin complémentaire allant de 3’ en 5’ dans la séquence donnée, il faut donc « inverser » la séquence de l’amorce A2 afin de trouver où elle s’hybride (s’associe de par sa complémentarité) au brin complémentaire. La lecture s’effectue toujours de 5’ en 3’, mais cette polarité du brin complémentaire est l’inverse de celle du brin codant : 3) Estimez la taille, en nucléotides, du fragment qui est amplifié à l’aide des amorces A1 et A2 (fragment X) Pour faire cela il faut trouver quelle est la position du premier nucléotide amplifié avec les amorces A1 et A2, ainsi que la position du dernier nucléotide amplifié. C’est le produit final de la PCR (amplicon) qui contient des séquences d’ADN de la même taille, taille définie par les amorces utilisées. L’amorce A1 commence à amplifier un fragment à partir du nucléotide numéro 817. Le produit de PCR se termine au dernier nucléotide compris avec l’amorce A2.  1967 – 817 + 1 = 1151 (taille en paires de base du produit de PCR) (*) (Explication du calcul : pourquoi «+1 » ? Imaginer que vous vouliez compter combien de piquets constituent la clôture devant chez vous (il y en a 20 en tout). Vous les numérotez de 1 à 20. Pour savoir combien vous en avez, vous pouvez faire la différence du plus grand par le plus petit (20-1), mais cela vous dira combien vous en avez rajouté à partir du premier, pas le nombre total, il faudra donc rajouter 1. C’est la même chose ici, pour avoir le nombre total de nucléotide il faut soustraire à la position du dernier, la position du premier et ajouter 1). Fragment X taille estimée: ……1151……… bps (paires de bases) 4) A l’aide de la liste des enzymes (annexe) de restriction dont les séquences sont présentes dans le gène du CFTR, identifiez et marquez sur la séquence (carte) de CFTR le ou les site(s) de restriction pour l’enzyme HincII qui coupent dans le fragment X entre les positions 1483 et 1880. Notez que HincII coupe la séquence palindromique ci-dessous où Y représente C ou T et R représente A ou G et qu’exceptionellement pour cette enzyme le site n’est pas toujours palindromique (les deux R et Y peuvent être une base différente sur chaque brin). Il y a donc quatre possibilités de séquences reconnues par HincII : 5’-GTCAAC-3’ (A) 3’-CAGTTG-5’ 5’-GTCGAC-3’ (B) 3’-CAGCTG-5’ 5’-GTTAAC-3’ (C) 3’-CAATTG-5’ 5’-GTTGAC-3’ (D) 3’-CAACTG-5’ Les formes (B) et (C) sont palindromiques, vous pouvez lire la séquence du brin codant ou du brin complémentaire de 5’ et 3’ et vous obtenez la même séquence pour chacune d’elle. (Forme (B) : brin codant : 5’-GTCGAC-3’, brin complémentaire : 5’- GTCGAC-3’). Les formes (A) et (D) sont identiques, mais ne sont pas palindromiques (si vous en retournez la forme (A), vous obtenez la forme (D)). L’annexe 2 vous indique les positions où l’enzyme de restriction coupe la séquence du CFTR : On vous indique dans la donnée qu’il faut chercher où cette enzyme coupe le gène entre les positions 1483 et 1880. Le seul site qui existe dans cet intervalle est à la position 1786. Si on regarde la séquence du CFTR proche de cette position : C’est donc la possibilité (A) (ou (D) étant donné qu’elles sont équivalentes) qui a un site de restriction à la position 1786. 5) Etant donné que la mutation G551D est localisée, entre les positions 1483 et 1880, dans le fragment X amplifié, et qu’elle affecte un site codant pour une glycine et un site de restriction HincII, identifiez et marquez la glycine mutée en position 551 sur la carte de CFTR. Selon le code génétique (voir dernière slide du document « Analyse génétique par PCR_2020.pdf »), il existe deux façons de transformer une glycine en acide aspartique : Au niveau de l’ARN (les couleurs reprennent celle du tableau du code génétique présenté dans le document « Analyse génétique par PCR_2020.pdf) : GGU -> GAU GGC -> GAC Ce qui au niveau de l’ADN correspond aux séquences suivantes : GGT -> GAT GGC -> GAC Comme cette mutation doit affecter un site de restriction pour HincII, il faut regarder si l’une de ces deux séquences est observée dans le site reconnu par HincII et dont la mutation affecterait ce site de restriction. Effectivement la séquence correspondant à la mutation GGT (glycine, allèle non muté) -> GAT (acide aspartique, allèle muté) est observée dans la séquence (non mutée du CFTR, donc la séquence GGT) au niveau du site reconnu par HincII. Ce codon GGT code effectivement pour une Glycine (indiqué par la lettre G sous le codon). Pour information, les symboles à une lettre utilisés pour représenter les acides aminés sont donnés dans le tableau ci-dessous : Si on lit la séquence ADN indiquée ci-dessus de 5’ en 3’, les CODONS présents codent pour les acides aminés suivants (dans l’ordre) : Isoleucine-Thréonine-Leucine-Serine-Glycine-Glycine-Glutamine-Arginine-Alanine-etc… 6) En sachant que la mutation G551D est causée par une mutation ponctuelle d’une seule base d’ADN qui code pour le mauvais nucléotide, que cette mutation détruit le site HincII et change l’acide aminé glycine en acide aspartique, déduire quel nucléotide est touché par cette mutation et quel est la séquence nucléique mutée en G551D. Utilisez le code génétique (cours) pour répondre. Comme on l’a vu dans la question précédente, il existe deux façons de changer un CODON codant pour une glycine en un CODON codant pour un acide aspartique : GGT -> GAT GGC -> GAC Celle qui nous intéresse est la version GGT -> GAT (c’est celle présente qui va faire disparaitre le site pour HincII) Indiquez une région de 10bps qui entourent le site muté et soulignez la mutation: ………………………………AGT GGA GAT CAA CGA……………………………………………………. 7) A l’aide de la liste des enzymes de restriction pour le CFTR en annexe, identifiez et marquez sur la séquence (carte) de CFTR le ou les site(s) de restriction pour l’enzyme MboI qui coupent dans le fragment X, entre les positions 1483 et 1880. A nouveau, si on regarde quels sont les sites de restriction de MboI présents dans la séquence du CFTR donné dans l’annexe, on trouve : Le seul site qui se trouve entre la position 1483 et 1880 est le site trouvé à la position 1504. 8) Analysez la séquence nucléotidique mutée en G551D et identifiez si le changement nucléotidique chez les patients atteints de cette mutation affecte le clivage du fragment X par MboI. Décrire comment la mutation affecte les sites de clivage par HincII et MboI Avec le mutation G551D, on crée un site reconnu par MboI uploads/Geographie/ corrige-exercice-pcr-2020.pdf