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See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/350357110 COURS DE TECHNIQUES D'ANALYSE MICROBIOLOGIQUE Book · March 2021 CITATIONS 0 READS 4,001 1 author: Some of the authors of this publication are also working on these related projects: Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) and drought tolerance View project Phenolic compounds View project Asmaa Benaissa University of Science and Technology Houari Boumediene 19 PUBLICATIONS 23 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Asmaa Benaissa on 24 March 2021. The user has requested enhancement of the downloaded file. REPUBLIQUE DEMOCRATIQUE ALGERIENNE ET POPULAIRE Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université Amine Elokkal El Hadj Moussa Eg Akhamouk Tamanrasset Faculté des Sciences et de la Technologie Département Biologie Polycopié du cours TECHNIQUES D’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE Avec exercices corrigés 3ème Année Licence Microbiologie Dr Asmaa BENAISSA (Enseignante-chercheuse à l’Université de Tamanrasset) AVANT-PROPOS Cet ouvrage, est adapté aux programmes des licences en microbiologie, contrôle de qualité et biotechnologie, s’adresse tout d’abord aux étudiants de ces spécialités. En revanche, tous les éléments de base de la pratique microbiologique décrite dans ce manuscrit serviront tout aussi aux techniciens des laboratoires des secteurs industriel, agroalimentaire et clinique. Le cours sert de base à la résolution des exercices et des problèmes répertoriés, avec leurs corrigés à la fin du manuscrit. Les questions correspondent aux compétences attendues par le programme. Cet ouvrage est le fruit des connaissances pratiques de la microbiologie et d’une adaptation des programmes des spécialités ayant un enseignement de microbiologie. C’est donc un support pédagogique effectif utilisant un style relativement simple et clair et organisé les chapitres. Le manuscrit est scindé en sept principaux chapitres classés selon un ordre chronologique d’une analyse microbiologique (étape par étape). En effet, il débute par présenter les méthodes de stérilisation, connaissance de base pour une manipulation en vigueur. En deuxième lieu, les techniques de prélèvement sont expliquées car ils constituent étape primordiale pour commencer une étude microbiologique. Les autres chapitres, présentent les différentes procédures d’un isolement, ensemencement, observation, caractérisation morphologique et biochimique, et numération des microorganismes. L'objectif de cet ouvrage est de présenter de façon synthétique, mais précise les données classiques d’une analyse microbiologique. Par ailleurs, des illustrations personnelles sont incluses dans la mesure du possible, considérées comme partie attrayante pour les étudiants. - Ce document ne dispense pas les étudiants de la responsabilité d'assister aux cours - Auteur Pour toutes suggestions, e-mail : benaissa.asmaa@yahoo.fr Maître de conférences B au département des Sciences Biologiques, Université de Tamanrasset (CUT) et rattachée au laboratoire de biologie et physiologie des organismes à l’Université des Sciences et Technologie Houari Boumediene (FSB/USTHB), Alger. Je remercie de tout cœur le Professeur Ahmed ABDERRAHMANI (USTHB) et le Docteur Abdelkader BEKHTI (Université d’Adrar) pour l’évaluation de ce manuscrit. TABLE DES MATIERES Abréviations et acronymes Liste des tableaux et figures Chapitre I : Techniques de stérilisation 1 1. Stérilisation par les méthodes physiques 1.1. Stérilisation par la chaleur 1.1.1. Chaleur sèche 1.1.1.1. Flambage 1.1.1.2. Four pasteur 1.1.2. Chaleur humide 1.1.2.1. Autoclave 1.1.2.2. Bain marie 1.1.2.3. Pasteurisation 1.1.2.4. Thyndallisation 1.2. Stérilisation par filtration 1.3. Stérilisation par radiation 2. Stérilisation par les méthodes chimiques 2.1.1. Antiséptiques liquides 2.1.2. Antiséptiques gazeux Chapitre II : Méthodes de Prélèvement 1. Echantillonnage 2. But 3. Précautions particulières 4. Plan d’échantillonnage 4.1. Plan à deux classes 4.2. Plan à trois classes 5. Mode de conservation Chapitre III : Les milieux de culture 1. Définition 2. Préparation du milieu de culture 2.1. Considérations générales 2.2. Cas particuliers 3. Types de milieux 3.1. Classification selon la composition 3.1.1. Milieux synthétiques 3.1.2. Milieux complexes 3.1.3. Milieux enrichis 3.2. Classification selon l’utilisation 3.2.1. Milieux sélectifs 3.2.2. Milieux différentiels 3.2.3. Milieux d’enrichissement 4. Caractéristiques de quelques milieux de culture 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 5 5 6 6 6 7 7 7 7 8 8 9 9 10 10 10 10 11 11 11 11 11 12 13 13 13 13 14 Chapitre IV : Méthodes d’observation des microorganismes 1. Observation macroscopique des colonies 1.1. Conditions d’examen 1.2. Aspect des colonies 1.3. Principaux types de colonies 2. Observation microscopique 2.1. Examen à l’état frais 2.1.1. Les formes 2.1.2. Le mode des groupements 2.1.3. La mobilité 2.2. Examen après coloration 2.2.1. Coloration simple 2.2.2. Coloration spécifique 2.2.3. Coloration double Chapitre V : Techniques de la culture bactérienne 1. Notions sur la culture 2. Réalisation d’une dilution décimale 2.1. Matériel 2.2. Mode opératoire de la réalisation des dilutions en série ou successives (10-1, 10-2, 10-3,….) 3. Technique d’ensemencement 3.1. Principe et but 3.2. Technique 4. Technique d’isolement 5. Conservation des souches Chapitre V : Dénombrement des microorganismes 1. But 2. Numération en surface 2.1. Technique de « SURFACE COUNT » 2.2. Technique des gouttes « DROP COUNT » 2.3. Technique de la membrane 2.4. Technique de « DIP SLIDES » 2.5. Cellules de comptage 3. Numération en milieu gélosé 3.1. Technique standard « PLATE COUNT » 3.2. Technique de la double couche 3.3. Technique du « ROLL TUBE COUNT » 3.4. Technique des gouttelettes d’agar 4. Exemple : Dénombrement des coliformes totaux et fécaux 4.1.Principe 4.2.Mode opératoire 4.3.Expression des résultats 4.4.Méthode NPP 15 15 15 15 16 17 17 17 17 17 18 19 20 21 22 22 24 24 24 25 25 26 26 26 27 28 28 28 28 28 29 29 29 30 30 30 30 30 31 31 31 31 32 4.4.1. Principe 4.4.2. Technique Chapitre VI : Mise en évidence du type de métabolisme bactérien 1. Métabolisme énergétique 1.1. Type respiratoire 1.2. Test de catalase 1.3. Test d’oxydase 1.4. Recherche de la nitrate-réductase (Test de GRIESS-ILOSVAY) 1.5. Épreuve de HUGH et LEIFSON 1.6. Test de mannitol-mobilité-nitrate 2. Métabolisme glucidique 2.1. Auxanogramme 2.2. Etude de la voie fermentaire des Acides 2.3. Test ONPG : recherche de la β galactosidase 3. Métabolisme protidique 3.1. Métabolisme de l’urée et du tryptophane 3.2. Recherche des décarboxylases LDC et ODC et de l’arginine dihydrolase ADH 4. Activité hydrolytique 4.1. Hydrolyse des protéines 4.2. Hydrolyse des polysaccharides 4.3. Hydrolyse des lipides 5. Galeries API 5.1. Définition 5.2. Choix de galerie 5.3. Technique 5.4. Exemples 5.4.1. API 20 E 5.4.2. API 10 Staph 5.4.3. API 20 NE 5.4.4. API 20 Strep Chapitre VII : Antibiogramme 1. Définition 2. Principe 3. Mode opératoire 4. Interprétation 5. Concentration minimale inhibitrice 5.5. Définition 5.6. But 5.7. Technique Références bibliographiques Exercices Résolution des exercices 32 32 34 34 34 35 35 36 37 37 38 38 39 39 40 40 41 42 42 43 44 45 45 46 46 47 47 48 49 50 51 51 51 52 53 53 53 53 54 55 57 62 ABREVIATIONS ET ACRONYMES ADH : Arginine di-hydrolase ANC : Acide Nalidixique Colistine BCPL : Bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol CMI : Concentration Minimale Inhibitrice H2O2 : Peroxyde d’hydrogène HCO3 : Hydrogénocarbonate KNO3 : Nitrate de Potassium KOH : Hydroxyde de Potassium LDC : Lysine décarboxylase NaCl : Chlorure de sodium NH2 : Ion amidure (amine) NR : Nitrate Réductase O2 : Dioxygène ODC : Ornithine décarboxylase OH : Radical hydroxyle OGA : Oxytétracycline Gélose Agar ONPG : l’Ortho Nitro Phényl Galactopyranoside TDA : Tryptophane désaminase RM : Rouge de Méthyle VP : Voges Proskauer UNITES : g.L-1 : Gramme par litre M : Molaire rpm : Rounds per minute (tours par minute) UFC/gr : Unité Formant Colonie par gramme LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES LES FIGURES Figure 1 : Figure 2 : Figure 3 : Figure 4 : Figure 5 : Figure 6 : Figure 7 : Figure 8 : Figure 9 : Figure 10 : Figure 11 : Figure 12 : Figure 13 : Figure 14 : Figure 15 : Figure 16 : Figure 17 : Figure 18 : Flambage d’une pipette Pasteur au niveau de la flamme bleue du bec Bunsen Photographie représentant un four Pasteur Photographie d’un autoclave de paillasse Photographies de deux modèles de bain-marie de paillasse Illustration d’une stérilisation par filtration Hotte - Poste de sécurité microbiologique (PSM - classe II) muni de lampe UV germicide Préparation d’un milieu de culture dans un flacon de 1L sur un agitateur magnétique à plaque chauffante Morphologie des colonies bactériennes Etapes de préparation d’une lame d’examen à l’état frais Formes et modes de groupements des cellules bactériennes Préparation d’un frottis bactérien sur une lame en verre Observation microscopique de bactéries de forme bacille groupées en courte chainette après coloration simple au bleu de méthylène grossissement × 100. Observation microscopique de la coloration de Gram de bactéries sous microscope optique au grossissement X100 (A- Cocci Gram positif, B- Bacille Gram négatif Préparation des dilutions décimales consécutives Boite de Pétri ensemencée en strie sur la surface d’un milieu de culture solide Etapes de réalisation d’un ensemencement en strie sur un milieu solide à l’aide d’une pipette Pasteur Schéma d’une cellule de comptage des bactéries « Thoma » Résultat positif de la présence des coliformes fécaux (production de gaz et apparition d’un anneau rouge à la surface) 2 2 3 4 5 6 11 17 17 18 19 19 20 25 26 uploads/Geographie/ coursde-techniquesd-analyse-microbiologique.pdf