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Préparé Par : Guizani Imen Rapport d’atelier en microbiologie : les milieux de

Préparé Par : Guizani Imen Rapport d’atelier en microbiologie : les milieux de culture et l’ensemencement Mastère professionnel Co-Construit en technologies cellulaires et moléculaire en bio santé 1 Plan de travail 1. Introduction 2. Les milieux de culture 2.1.Classification des milieux de culture On distingue en général : 2.1.1. Les milieux usuels ou milieux de base 2.1.2. Les milieux d’isolement 2.1.3. Les milieux d’identification 2.1.4. Les milieux de conservation 2.2.Qualités exigibles d’un milieu de culture 2.2.1. La composition 2.2.2. PH 2.2.3. L’isotonie 2.2.4. Le potentiel d’oxydoréduction 2.2.5. L’humidité 2.3.Stérilisation des milieux de culture 2.4.Recommandations pour l’utilisation de milieux déshydratés Intérêt 2.5.Conservation 2.5.1. Milieux en poudre 2.5.2. Milieux réhydratés 2.6.Examens macroscopique et microscopique des microorganismes 2.6.1. Examen macroscopique 2.6.1.1. Les cultures bactériennes sur gélose 2.6.1.2. Cultures bactériennes en bouillon 2.6.2. Examen microscopique 3. Techniques d’ensemencement 3.1. Ensemencement sur un milieu liquide 3.1.1. Culture à partir d’un prélèvement liquide 3.1.2. Culture à partir d’un prélèvement en milieu solide 3.2. Ensemencement sur un milieu solide 3.2.1. Culture en tubes Milieux solidifiés inclinés 3.2.2. Milieux en culot 3.2.3. Milieu en culot + pente 3.2.4. Milieu d’ensemencement en masse 3.2.5. Cultures en boites de pétri par la méthode de stries 4. Conclusion 2 1. Introduction Avec la découverte des milieux de culture, on est passé du simple examen microscopique à l’isolement des bactéries sur des milieux permettant leur croissance et par la suite leur identification biochimique et enfin l’étude de leur sensibilité aux antibiotiques. 2. Les milieux de culture La plupart des techniques bactériologiques exigent l’utilisation de milieux de culture. Ceux-ci contiennent les substances nutritives indispensables à la croissance des microorganismes. Ils sont disposés dans des récipients en verre de différentes formes (tubes, erlenmeyer, boites de pétri) préalablement stérilisés. Les milieux de culture sont liquides ou solides. Les microbes, au cours de leur développement, troublent uniformément les milieux liquides ou encore forment des agglomérats, des dépôts, des voiles superficiels. Sur les milieux solides, ils peuvent former une nappe confluente lorsque les germes ont été déposés en grand nombre à sa surface. Si les cellules bactériennes sont isolées, leurs descendants s’accumulent en une masse souvent bien délimitée appelée « une colonie » et dont l’aspect, les dimensions, les contours, la structure sont autant de caractères précieux permettant son identification 2.1. Classification des milieux de culture On distingue en général : 2.1.1. Les milieux usuels ou milieux de base Ils permettent la culture de toutes les bactéries. Le choix d’un milieu usuel est en général fonction de l’habitat naturel des bactéries à isoler. - Milieux à base d’extraits de viande utilisés pour la culture des microbes commensaux et pathogènes de l’homme et des animaux. - Milieux à base de lait, d’extraits végétaux utilisés en bactériologie alimentaire… etc. 3 2.1.2. Les milieux d’isolement Ils peuvent être selon les techniques et les bactéries : - Les milieux de base déjà cités. - Les milieux enrichis de produits biologiques tels que : sang, sérum, lait, levure…etc. - Les milieux électifs ou sélectifs : ils favorisent la croissance d’une ou de plusieurs espèces bactériennes particulières. Un milieu électif est un milieu sur lequel apparait une culture abondante et rapide de certaines bactéries, alors que la plupart des espèces bactériennes s’y développent peu et lentement. Un milieu sélectif est un milieu ne permettant la croissance que d’une espèce bactérienne ou d’un groupe d’espèces bactériennes. La croissance des autres bactéries est entravée ou inhibée. L’effet sélectif est obtenu en jouant sur les facteurs physico-chimiques (tels que pression osmotique, pH, …) ou par l’action bactériostatique ou bactéricide de certaines substances telles que : sels minéraux (azide de sodium, tellurite de sodium, …) ; substances organiques (eau peptonée phéniquée) ; ou des substances colorantes (vert brillant, vert malachite, cristal violet, …). 2.1.3. Les milieux d’identification Ils permettent la mise en évidence des caractères biochimiques des bactéries et, en conséquence, de résoudre les problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou genres voisins. 2.1.4. Les milieux de conservation Ils permettent la survie des bactéries dans un état de vie ralentie. La plupart des milieux de culture utilisés en bactériologie dérivent du bouillon de viande qui reste le plus courant des milieux liquides. La gélose nutritive, milieu solide, est la base de tous les milieux d’isolement et n’est en fait qu’un bouillon solidifié par l’agar- agar (mucilage d’origine végétale). L’agar-agar est un polyoside à haut poids moléculaire tiré de certaines algues rouges (Rhodophycées). L’agar-agar peut absorber et solidifier (ou gélifier) 300 à 500 fois son poids d’eau. 2.2. Qualités exigibles d’un milieu de culture 4 Certaines qualités sont indispensables à un milieu pour favoriser le développement bactérien et qui sont relatives à : 2.2.1. La composition Le milieu de culture doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes et assimilables par eux. - Aliments essentiels azotés et carbonés. - Facteurs de croissance (métabolites essentiels que la bactérie est incapable de synthétiser). - Facteurs stimulants ou facteurs de départ dont la présence accélère le rythme de la multiplication bactérienne ou permet l’adaptation à un milieu artificiel d’une bactérie isolée d’un milieu naturel. 2.2.2. PH En général, les bactéries à un pH voisin de la neutralité (pH 7 à 7.6) ; certaines d’entre elles exigent ou supportent un pH particulier. 2.2.3. L’isotonie Elle correspond pour la plupart des milieux à celle d’une solution de NaCl à 9‰. 2.2.4. Le potentiel d’oxydoréduction Les bactéries ont des exigences strictes, en rapport avec leur type respiratoire. 2.2.5. L’humidité L’eau est nécessaire au métabolisme bactérien, les milieux de culture doivent en contenir une quantité suffisante. Il convient de rappeler également qu’il est indispensable que l’incubation soit effectuée à la « température optimale » de croissance des bactéries à cultiver. 2.3. Stérilisation des milieux de culture Les milieux de culture sont stérilisés à la vapeur d’eau sous pression. L’appareil permettant d’atteindre ces conditions est appelé « autoclave », son principe est le suivant : quand la pression augmente la température de l’eau s’élève et atteint 250°F ou 121°C à 2 atmosphères ou 15 livres de pression. Plusieurs facteurs contribuent à l’obtention d’une stérilisation parfaite dont la température de chauffage, le volume des récipients à stériliser, la nature des produits à stériliser, le degré thermique, etc. La chaleur humide agit sur les bactéries en entrainant la dénaturation de leurs protéines. Les milieux renfermant des sucres sont stérilisés à une température ne dépassant pas 116 à 118°C. D’une manière générale, il faut éviter de trop chauffer les milieux de culture. Certains milieux peuvent être utilisés sans qu’il soit nécessaire de les stériliser à l’autoclave. 2.4. Recommandations pour l’utilisation de milieux déshydratés Intérêt 5 Les milieux déshydratés présentent de nombreux avantages : - Ils sont très stables. - Leur utilisation étant simple, ils peuvent être préparés peu de temps avant leur mise en service. - Un faible volume de poudre permet la préparation d’une quantité importante de milieu, leur stockage ne nécessite qu’un emplacement restreint. - Ils sont économiques. Préparation La technique pour réhydrater les milieux secs est très importante pour obtenir des produits de bonne qualité. - Il convient de ne commencer à faire dissoudre la quantité de poudre nécessaire que dans une partie du volume total d’eau distillée. - Bien mélanger, puis ajouter le reste d’eau distillée en rinçant les parois du récipient. - Il est possible d’accélérer la dissolution en utilisant de l’eau à 45-50°C. Le chauffage est parfois nécessaire pour obtenir une mise en solution complète. Dans ce cas, il faut agiter le mélange eau-poudre de temps en temps ou en utilisant un agitateur magnétique. Si le milieu est gélosé, attendre 5 minutes en agitant fréquemment avant de le porter à ébullition. Ne jamais surchauffer inutilement (en règle générale, une à deux minutes d’ébullitions suffisent). - Vérifier ensuite le pH et l’ajuster, si nécessaire, à la valeur indiquée sur la fiche technique. Il est indispensable d’effectuer cette vérification, car le pH de l’eau distillée peut varier selon les conditions d’obtention et de stockage. Les milieux ainsi préparés n’ont pas besoin d’être filtrés. Dans tous les cas, il faut respecter les indications portées sur les étiquettes des boites et ne jamais dépasser la température de stérilisation. 2.5. Conservation 2.5.1. Milieux en poudre - Les milieux déshydratés sont très hygroscopiques. Il est donc indispensable de refermer rapidement les boites aussitôt le prélèvement de poudre effectué (ne pas oublier de replacer la capsule hermétique). - Conserver les boites à l’abri de la lumière, dans endroit frais et sec. - ne pas utiliser de milieux fortement réhydratés. 2.5.2. Milieux réhydratés - Après stérilisation, il est nécessaire de conserver les milieux dans de bonnes conditions. - Les milieux devant être stockés avant leur utilisation sont protégés de la dessiccation et de la lumière. Pour cela, il est indispensable de fermer les récipients qui les contiennent par capuchons en caoutchouc ou des capsules vissées. 6 - Les milieux gélosés, coulés en boites de pétri, doivent être de préférence utilisés le jour même de leur préparation. Il est toutefois possible de les conserver quelques jours au 5 réfrigérateur, mais il est uploads/Geographie/ rapport-microbiologie.pdf