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Rapport de projet de fin d’étude Filière : Licence Appliquée en Biotechnologie

Rapport de projet de fin d’étude Filière : Licence Appliquée en Biotechnologie Parcours : Licence Co-construite Biotechnologie marine et Aquaculture Réalisé par : Mned Syrine Sous la direction de : Pr. MAAROUFI Raoui Mounir Président : Dr. NASRI Rim Examinateur : Encadrant : Dr. ZAOUALI Amine Pr. MAAROUFI Raoui Mounir Laboratoires d’accueil : Laboratoire de Génétique, Biodiversité & Valorisation des Bioressources (GBVB) République Tunisienne Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique UNIVERSITE DE MONASTIR Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir Caractérisation partielle et évaluation du pouvoir antioxydant d’un acide hyaluronique de différentes origines Soutenu le 28 Juillet 2020 devant le jury composé de : Année Universitaire : 2019 / 2020 Dédicaces Je dédie cet humble travail avec grand amour, sincérité & fierté : A mes chers parents Ahlem & Imed Pour tous leurs sacrifices, leur amour, leur tendresse, leur soutien et leurs prières tout au long de mes études. A mes chers frères Yassine & Wassim Pour leurs encouragements permanents, et leur soutien moral. A mon cher petit frère Anas que j’aime tant A mes meilleurs amies Balkis, Bouthaina & Amal Pour leur fidélité et avec lesquelles j’ai partagé mes moments de joie et de bonheur. A tous mes amies et collègues surtout Anas, Ramla, Hajer, Neila, Khadija, Seif, Kawther & Waness Pour votre encouragement et votre présence morale, je vous aime profondément. A tous mes professeurs & à tous ceux que j’aime et qui m’aiment et à tous ceux qui compulsent ce modeste travail. Je dédie ce travail espérant avoir répondu à leurs souhaits de me voir réussir … Remerciements Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont participé de près ou de loin à l’aboutissement de ce projet. J’espère n’oublier personne et si c’est le cas, j’espère que ces personnes me pardonneront. Je commence par remercier mon encadreur le Professeur Raoui Mounir MAAROUFI, pour m'avoir fait l'honneur d'encadrer ce travail et pour son dynamisme pour la recherche scientifique, qui a été pour moi une source de motivation. Je le remercie pour tous le savoir qui m'a transmit, pour ses conseils et ses commentaires qui ont enrichis mon travail expérimental et ma rédaction. Qu'il soit assuré de ma profonde gratitude. Je tiens particulièrement à remercier, le Professeur Imed MESSAOUDI qui m’a donné l’occasion d’être stagiaire au laboratoire Génétique, Biodiversité et Valorisation des Bioressources. Je tiens à remercier les membres de jury pour bien vouloir m’accorder de leur temps précieux pour évaluer mon travail. Je remercie tout d’abord la Docteur Rim NASRI d’avoir accepté de présider ce jury et pour son intervention dans la discussion lors de la soutenance. Je remercie vivement le Docteur Amine ZAOUALI pour l’honneur qu’il m’a fait d’avoir accepté d’examiner mon travail et pour les corrections et les remarques précieuses dont il m’a fait profiter, très utiles pour la suite de mon parcours. Un grand merci à la Doctorante Sawssen ELHISS pour avoir également contribuée à ce travail et pour avoir mis à ma disposition les ressources nécessaires à la réalisation de ce projet et pour m’avoir fait profiter de sa générosité durant le parcours de mon travail. Je la remercie du soutien infini, merci pour la disponibilité, l’écoute, l’aide et le soutien moral dont elle a fait preuve à mon égard. Enfin, je ne peux achever ce projet sans exprimer ma gratitude aux techniciens, au sein du laboratoire Génétique, Biodiversité et Valorisation des Bioressources, Nabil SOLTANI et Saousen REBHI. Sommaire INTRODUCTION Synthèse Bibliographique I- Les polysaccharides..........................................................................................................................3 I-1-Généralités sur les polysaccharides...........................................................................................3 I-1-1-Les homopolysaccharides:..................................................................................................3 I-1-2-Les hétéropolysaccharides:.................................................................................................3 I-2-Les glycosaminoglycanes (GAGs).............................................................................................4 I-2-1-Généralités :.........................................................................................................................4 I-2-2-Les glycosaminoglycanes (GAGs): Structure et origine :.................................................5 I-3-L’acide hyaluronique: Localisation tissulaire et propriétés physico-chimiques....................9 I-3-1-Localisation tissulaire :.......................................................................................................9 I-3-2-Propriétés physico-chimiques :..........................................................................................9 I-4-Acide hyaluronique et matrice extracellulaire.......................................................................10 I-5-Origines cellulaires et biosynthèse de l'acide hyaluronique..................................................11 I-6-Fonctions biologiques de l'acide hyaluronique.......................................................................12 I-7-Les applications de l'acide hyaluronique................................................................................13 I-7-1-Application biomédicales :................................................................................................13 I-7-2-Applications pharmaceutiques :.......................................................................................14 I-7-3-Applications cosmétiques :...............................................................................................14 I-8-Propriétés antioxydantes de l’AH...........................................................................................14 Matériel et méthodes I. Matériel...........................................................................................................................................16 I.1 Crêtes de poulets :.....................................................................................................................16 I.2 Peau de poisson cartilagineux : Raja radula............................................................................17 I.3 Polysaccharides standards :.....................................................................................................18 I.4 Enzyme :....................................................................................................................................18 I.5 Divers :.......................................................................................................................................18 I.6 Composition des réactifs et solutions tampons :.....................................................................18 I.6.1 Extraction des glycosaminoglycanes :...............................................................................18 I.6.2 Estimation de la pureté des polysaccharides par électrophorèse sur acétate de cellulose :.....................................................................................................................................18 I.6.3 Dosage des sucres totaux :.................................................................................................18 I.6.4 Dosage des acides uroniques :...........................................................................................19 I.6.5 Activité antioxydante :.......................................................................................................19 I.7 Appareillage :............................................................................................................................19 II. Méthodes........................................................................................................................................19 II-1 Méthodologie d’extraction des glycosaminoglycanes:..........................................................19 II-1-1- Délipidation.....................................................................................................................20 II-1-2- Extraction et purification des polysaccharides par digestion enzymatique :.............20 II-2- Chromatographie échangeuse d'anions sur DEAE-cellulose :...........................................21 II-3- Electrophorèse sur bande d’acétate de cellulose :...............................................................21 III. Caractérisation physico-chimique..............................................................................................22 III-1-Composition centésimale :....................................................................................................22 III-2- Dosage des sucres totaux :...................................................................................................22 III-3- Dosage des acides uroniques :.............................................................................................22 III-4- Spectroscopie Infra-Rouge :................................................................................................22 IV-Mise en évidence des activités antioxydantes :...........................................................................23 IV-1-Test de réduction du radical DPPH (2,2’-diphényl-1-picrylhydrazyle).............................23 IV-2-Test du pouvoir réducteur du fer (FRAP : ferric reducing antioxydant power)..............24 Liste des abréviations AH : Acide hyaluronique AHC : Acide hyaluronique commercial AU : Acide uronique CCP : Chlorure de cétylpyridinuim COOH : La fonction acide carboxylique CS : Chondroïtine sulfate DO : Densité optique DPPH : 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyle DS : Dermatane sulfate EDTA : Ethylène diamine tétraacétique Fe Cl3 : Solution de chlorure ferrique FPB : Fraction polysaccharidique brute FRAP : Ferric ion Reducing Antioxydant power FTIR : Spectroscopie infrarouge à transformée de fourrier GAGs : Glycosaminoglycanes Gal N : Galactosamine Gal NAc/s : N-Acétyl Galactosamine sulfate Gal : Galactose Glc A : Acide Glucuronique Glc N : Glucosamine H : Héparine H2SO4 : Acide sulfurique HAS : Acide hyaluronique synthétase HCl : Acide chlohydrique HexA : Acide hexuronique HS : Héparane sulfate IC50 : Concentration équivalente à 50% IdoA : Acide Iduronique IR : Spectroscopie infrarouge K2S2O4 : Sulfate de potassium K3[Fe(CN)6 : Ferricyanure de potassium KBr : Bromure de potassium kDa : kilo-dalton KS : Kératane sulfate MEC : Matrice extracellulaire MgCl2 : Chlorure de magnésium Mw : Masse moléculaire moyenne en poids Nacl : Chlorure de sodium NH2 : La fonction amine OH : La fonction hydroxyle Liste des figures Figure 1 : La famille des Glycosaminoglycanes (GAGs)..........................................................4 Figure 2 : Structure chimique de chondroïtine sulfate (Gandhi et Mancera., 2008).................5 Figure 3 : Structure chimique de dermatane sulfate (Gandhi et Mancera., 2008).....................6 Figure 4: Structure chimique de l’héparine (Montpas et al., 2011)...........................................6 Figure 5: Structure chimique de l’héparane sulfate (Gandhi et Mancera., 2008)......................7 Figure 6 : Structure chimique de Kératane sulfate (Mao et al., 2002).......................................8 Figure 7 : Structure chimique de l’Acide hyaluronique (Necas et al., 2008)............................8 Figure 8 : Formation d’un gel à l’extrémité d’une feuille d’acide hyaluronique (Price et al., 2007).........................................................................................................................................10 Figure 9 : Structure d'un agrégat de protéoglycanes au sein de la MEC (Simon, 2015).........11 Figure 10 : Mécanisme de biosynthèse de l’acide hyaluronique (Dicker et al., 2014)............12 Figure 11 : Applications biomédicales de l'acide hyaluronique (de Oliveira et al., 2016)......14 Figure 12 : photo du poulet de chair........................................................................................16 Figure 13 : photo de raie Raja radula (Raie-râpe)...................................................................17 Figure 14 : Les étapes d’extraction de la fraction polysaccharidique brute (FPB)..................20 Figure 15 : Réduction du radical DPPH (Muhammad et al., 2013).........................................23 Figure 16 : Réaction de test FRAP (Ferric reducing antioxydant power) (Prior et al., 2005).24 Liste des tableaux Tableau 1: Les fonctions biologiques de l’acide hyaluronique selon le type d’organe.......................12 INTRODUCTION 1 Introduction La valorisation des sous-produits de la pêche et de l’élevage qui sont de faible valeur ajoutée et dans plusieurs de cas inexploités , en plus du respect de l’environnement, de maximiser le profit des entreprises. Elle consiste à les transformer de facon à ce qu’ils deviennent des matières premières pour la production d’autres produits à forte valeur nutritive ou l’extraction des molécules bioactives ayant des propriétés remarquables et originales qui peuvent être mises a profit pour l’application dans plusieurs domaines allant de l’agroalimentaire au domaine biomédical. Parmi ces molécules bioactives à extraire, les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polymères d’origine naturelle, existent sous de nombreuses formes et ont des propriétés qui les rendent extrêmement adaptés aux applications biomédicales, pharmaceutiques et cosmétiques. Ces polysaccharides sont abondamment retrouvée dans les tissus de vertébrés et d’invertébrés marins et terrestres et généralement ils sont sulfatés, de structure chimique complexe sauf l’acide hyaluronique est le seul GAG non sulfaté connu par une structure chimique simple et ses propriétes viscoélastique et hygroscopiques exceptionnelles. Dans le cadre de ce travail, nous nous proposons d’utiliser comme ressource marine, la peau du poisson cartilagineu (Raja radula, un poisson cartilagineux abondant sur les côtes tunisiennes et vendu sur le marché dépecé) et comme ressource aviaire, la crête du poulet. La peau de ce poisson et la crête du poulet étant considéré comme déchets. Dans la première partie de ce travail, nous avons procédé à l’extraction de la fraction polysaccharidique brute (FPB) à partir de la peau de la raie et les crêtes du poulet. Ceci a nécessité la collecte de la crête du poulet et de la peau de la raie sur le marché central de Monastir, une digestion enzymatique afin de libérer les GAGs et une précipitation au chlorure de cétylpyridinium (CCP) puis à l’éthanol. Cet ensemble d’étapes est suivi par une uploads/Geographie/ pfe-syrine.pdf