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FICHE TECHNIQUE : PROTOCOLE D’EXTRACTION DE L’ADN PLASMIDIQUE Principes générau

FICHE TECHNIQUE : PROTOCOLE D’EXTRACTION DE L’ADN PLASMIDIQUE Principes généraux : C’est une technique de séparation biochimique par précipitations différentielles et séparation des 2 phases obtenues liquide / solide par centrifugation. Protocole : Récupération et lavage des cellules : Prélever 1.5 ml de suspension bactérienne ; placer en microtubes stériles Centrifuger à 12 000 g pendant 3 minutes Eliminer le surnageant Ajouter 1.5 ml de suspension bactérienne Centrifuger à 12 000 g pendant 3 minutes Eliminer le surnageant Remettre le culot en suspension dans 150 l de tampon Tris-HCl 25 mM pH 8 ; EDTA 10 mM Lyse des cellules : Ajouter 300 l de soude 0.2 M, SDS 1% préparés extemporanément ; Laisser agir 5 minutes au plus. Purification de l’ADN plasmidique : Ajouter 225 l d’acétate de sodium 3 M, pH 5.2 pour réaliser la précipitation de l’ADN chromosomique dénaturé par la soude et des protéines complexées par le SDS (détergent) Mélanger par retournements successifs 6 à 10 X Placer les tubes dans la glace pendant 10 minutes Centrifuger 10 minutes à 12 000 g à température ambiante Récupérer le surnageant : volume v Ajouter 2v d’éthanol absolu à –20°C et placer à –20°C pendant 30 minutes pour précipiter l’ADN plasmidique Centrifuger 15 minutes à 12 000 g et à 4°C Eliminer le surnageant Remettre le culot en suspension dans 300 l d’éthanol à 75% Centrifuger 15 minutes à 12 000 g et à 4°C Eliminer le surnageant Sécher le culot quelques minutes à 37°C pour éliminer l’éthanol Remettre le culot en suspension dans 50 l d’ED stérile FICHE TECHNIQUE : ACTION DES ENZYMES DE RESTRICTION Protocole : Dans un microtube mettre : X l de la solution d’ADN plasmidique, X dépendant de la concentration en ADN de l’extrait qui peut être évaluée par spectrophotométrie à 260 nm grâce à la relation : 1 DO = 50 µg d’ADN (diluer l’ADN au 1/200ème dans l’ED avant de lire la DO) 1,5 l du tampon de restriction 1 l de chaque enzyme de restriction à 10 U/l QSP 15 l : ED stérile Mélanger brièvement Centrifuger à 4000 g quelques secondes Placer à l’incubation 2 H à 37°C 1 FICHE TECHNIQUE : ELECTROPHORESE D’ACIDES NUCLEIQUES Principes généraux : C’est une technique de séparation des molécules chargées, ici en fonction de leur taille. Tous les fragments d’ADN sont chargés négativement par perte de H+ en milieu tamponné basique. L’application d’un champ électrique va les faire migrer vers le pôle positif de la cuve. Les fragments vont se déplacer dans l’épaisseur d’un support, dans ce cas un gel d’agarose dont la maille est assez régulière et adaptée à la taille des fragments à séparer. Cette migration sera facilitée d’autant plus que la taille du fragment sera petite ; ce dernier migrera plus loin. La lecture d’un électrophorégramme nécessite une coloration ou une révélation. Dans le cas présent, la visualisation des fragments d’ADN sur le gel nécessite la présence de bromure d’éthidium, agent intercalant de l’ADN. Fixée à la double hélice d’ADN, cette molécule a la propriété d’émettre un rayonnement lumineux suite à une irradiation par les UV. Protocole : Préparation du support de migration : Dans un bécher, préparer de l’agarose à 1% (1g / 100 ml) dans du tampon de migration (TBE 1x) ; compter environ 30 à 40 ml par petite plaque de gel Placer au four à micro-ondes jusqu’à ébullition et obtention d’une phase homogène (limpide) Laisser refroidir jusqu’à ce qu’il soit possible de tenir le bécher dans la main, et, dans l’agarose encore liquide, incorporer le bromure d’éthidium à raison de 1 µg / ml final (soit 2 l d’une solution mère à 10 mg/ml pour 20 ml de gel) ATTENTION : ce produit se liant à l’ADN est donc hautement mutagène et donc cancérigène, par contact seulement : il est donc absolument INTERDIT de manipuler sans gants Placer les supports de gel dans les moules ainsi que les « peignes » côté sombre du support pour réserver l’emplacement des puits pour les dépôts. Veiller à ce que les puits ne perforent pas complètement le gel. Couler l’agarose toujours liquide dans les moules ainsi préparés ; Laisser refroidir et polymériser : prise du gel Retirer les peignes délicatement Préparation des échantillons à faire migrer : 5 l de solution d’ADN plasmidique non digéré + 5 l d’ED stérile + 2 l de tampon de charge Pour chaque échantillon d’ADN plasmidique digéré par les enzymes de restriction : totalité de l’échantillon (environ 15 l) + 2 l de tampon de charge Marqueurs de taille préparé dans le tampon de charge: 10 l Remarque : certains composants du tampon de charge ont la propriété de se lier à l’ADN pour augmenter sa densité afin qu’il reste dans les puits ; ce tampon contient du bleu de bromophénol permettant de visualiser la migration. Dépôts et migration : Remplir la cuve de tampon TBE 1x Immerger le gel et son support dans la cuve, les extrémités sans bordure (et les puits) face aux électrodes Injecter directement la totalité des échantillons préparés dans les puits, en y insérant très délicatement la pointe de la pipette automatique Laisser migrer à 100 V environ 30 minutes Visualisation : Enlever éventuellement le gel du support Placer le gel sur la plaque UV ATTENTION : les UV peuvent causer de très graves brûlures aux yeux notamment, ils sont également mutagènes et donc potentiellement cancérigènes du fait de leur absorption par l’ADN et des modifications qu’ils peuvent lui causer. Ils sont par contre très peu pénétrants et sont arrêtés par le verre, le plexiglas, l’eau, etc. Il est donc OBLIGATOIRE de fermer la plaque de protection de la table à UV et d’utiliser des gants pour manipuler les gels Examiner les résultats Faire une photo 2 FICHE TECHNIQUE : TECHNIQUES ELEMENTAIRES DE MICROBIOLOGIE Principes généraux : Les milieux de culture de bactéries existent sous forme liquide ou solide ; on obtient ces derniers en ajoutant de l’agar au milieu liquide. Les milieux solides sont coulés en fusion en boîte de pétri ou en tubes à vis. Ces milieux contiennent entre autres les éléments nutritifs nécessaires au développement des bactéries et éventuellement d’autres substances (exemple : antibiotiques, NaCl, etc.) Sur un milieu de culture favorable, une bactérie isolée lors de l’ensemencement également appelé clone bactérien va se diviser un grand nombre de fois et donner naissance à une colonie (ensemble d’individus rigoureusement identiques), visible à l’œil nu. Le milieu de culture étant un milieu favorable au développement des micro-organismes, le risque est très élevé d’avoir une contamination par des espèces indésirables ; il est donc nécessaire de travailler dans des conditions les plus stériles possibles : autour de la flamme d’un bec bunsen, sous une hotte à flux laminaire, etc. Le travail en conditions stériles permet aussi de protéger l’opérateur d’une contamination par des organismes potentiellement pathogènes. Protocoles d’ensemencement :  Il existe plusieurs techniques d’ensemencement visant à répartir et isoler les bactéries sur milieu solide à partir d’une suspension liquide : - par étalement : on dépose un faible volume de la suspension mère à la surface du milieu que l’on répartit le plus uniformément possible à l’aide d’un « râteau » - par stries, réalisées avec une œse ou une pipette pasteur boulée, d’une goutte apportée par l’outil préalablement trempé dans la suspension mère. Pour pallier à une trop forte concentration des colonies bactériennes, les stries peuvent être réalisées selon la technique des quadrants comme indiqué ci-dessous  L’ensemencement à partir d’une colonie sur milieu solide nécessite une étape préalable de mise en suspension de cette colonie prélevée à l’œse ou à la pipette pasteur boulée dans un tube à vis par agitation.  Les ensemencements des milieux liquides se font par simple immersion et agitation d’un outil contaminé. Stockage et mise en culture des milieux ensemencés : La boîte, le tube devront être renseignés de manière complète : nom de l’opérateur, milieu, date de mise en culture, organismes ensemencés, etc. Le développement des bactéries se fera bien à la température adéquate (souvent 37°C) et avec agitation des milieux liquides. Penser à stocker les boîtes de pétri couvercle vers le bas, sans quoi les gouttes de condensation tombant sur le milieu réalisent un ré- ensemencement rendant impossible la lecture. 3 uploads/Geographie/ tp-manip-elem-bio-mol-tech.pdf