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http://lewebpedagogique.com/bouchaud 13Energiecellule5.docx 1 Thème 1. Énergie et cellule vivante 5 Réactions de la respiration et synthèse d’ATP Une cellule eucaryote qui possède des mitochondries est capable de réaliser la respiration. Cette dernière se traduit par une consommation de glucose et d’O2, et un rejet de CO2. Travail de réflexion (15 minutes) : Montrer que la respiration se produit en plusieurs étapes, et que celles-ci sont couplées à la synthèse d’énergie (ATP). En premier lieu, on veut déterminer quel est le substrat utilisé par les mitochondries, ce qui nous permettra déjà de proposer une conclusion partielle. Pour cela, on va isoler des mitochondries. Matériel à votre disposition : - chou fleur - PC, interface ExAO, sonde à O2, logiciel Datastudio - Bioréacteur et agitateur magnétique - Solution de tampon phosphate à pH = 7,4 - Solution de pyruvate de sodium à 20 % tamponnée à pH = 7,4 - Mortier réfrigéré et pilon, bécher, entonnoir et support, gaze - Pipette 20 mL et propipette Expériences réalisables (45 min) : Isolement des mitochondries. - Couper suffisamment de fleurs en petits morceaux dans un verre de montre ; - Les mettre dans le mortier réfrigéré et ajouter 10 mL de solution tampon phosphate pH 7,4 - Broyer pendant une minute sans sable pour faire éclater les cellules végétales - Ajouter 20 mL de la même solution tampon - Broyer à nouveau 30 s - Filtrer au dessus d’un bécher sur 4 à 5 épaisseur de gaze On obtient ainsi une suspension (impure) de mitochondries en ayant éliminé un maximum de débris cellulaires. Mesures par ExAO : - Verser xx mL de la suspension de mitochondries dans le bioréacteur (suffisamment pour éviter la présence d’air lorsque le bouchon contenant la sonde O2 sera placé) - Lancer l’agitation (comme d’habitude, régler pour que l’agitateur ne tourne pas trop vite) - Introduire la sonde à O2 dans le bouchon 2 trous, placer le bouchon en vérifiant l’absence de bulles d’air (rajouter de la suspension dans le cas contraire). - Laisser la sonde s’équilibrer quelques minutes puis lancer la mesure. - Au temps t = 1 mn, injecter 0,2 mL de glucose 0,1 M - Au temps t = 2 mn, injecter 0,2 mL de pyruvate à 20 g.L-1 tamponné à pH 7,4 (ne pas oublier les repères sur le graphique). Production : - Graphique légendé et titré inséré dans une page Word (si expérience réussie). - Analyse graphique complète et comparaison à l’ExAO sur les levures (cellules entières). Documents complémentaires : les différentes phases de la respiration. Quelques informations pour les deux expériences ci-dessous. Certains traitements permettent d’isoler les différentes fractions de la mitochondrie. Ces dernières sont placées en présence de pyruvate et/ou d’O2 et la présence de CO2 est recherchée. Certains composés absorbent différemment les longueurs d’onde selon qu’ils sont à l’état oxydé ou réduit. Ainsi, R’H2 absorbe les longueurs d’onde à 350 nm alors que R’ ne les absorbe pas. La réduction de composés R’ en R’H2 est recherchée en incubant différentes substances impliquées dans la respiration et en suivant l’absorbance à 350 nm. L’oxydation du pyruvate en CO2 est due à un ensemble de réactions d’oxydoréduction formant une suite cyclique de réactions appelées cycle de Krebs. Structure étudiée Ajout de pyruvate Ajout de pyruvate et de O2 Membrane externe Pas de CO2 produit Pas de CO2 produit Membrane interne Pas de CO2 produit Pas de CO2 produit Matrice Dégagement de CO2 Dégagement de CO2 Étude du dégagement de CO2 par les différentes fractions mitochondriales. © Spécialité SVT Nathan 2012 Solutions testées Absorbance à 350 nm Composé oxydé R’ 0 Composé réduit R’H2 0,35 Protéines de la matrice + R’ 0 Protéines de la matrice + glucose + R’ 0 Protéines de la matrice + pyruvate + R’ 0,25 Mesures de l’absorbance à 350 nm de différentes solutions. © Spécialité SVT Nathan 2012 http://lewebpedagogique.com/bouchaud 13Energiecellule5.docx 2 D’autres expériences. Des suspensions de mitochondries sont placées avec des composés réduits R’H2 et en présence ou non de roténone, un inhibiteur des complexes d’oxydoréduction. La production d’ATP et la consommation d’O2 sont suivies au cours de l’expérience. Par ailleurs une observation microscopique de la membrane interne des mitochondries permet de localiser les enzymes de synthèse de l’ATP, les ATP synthases. Variation des concentrations en O2 et ATP avant et après ajout de roténone. Localisation des ATP synthases (au MET). Les deux documents © Spécialité SVT Nathan 2012 Production : - Analyser chaque expérience. Montrer, au fur et à mesure, en quoi elle répond à la problématique. Bilan : les étapes de la respiration : La glycolyse dans le hyaloplasme. Les trois documents : adapté d’après Spécialité SVT Belin 2012 Le cycle de Krebs dans la matrice mitochondriale Calcul du rendement de la respiration : Calcul du rendement (voir Belin page 37) : Sachant que l’oxydation complète du glucose libère 2840 kj.mol-1 utilisable, que le CO2 ne contient plus d’énergie chimique utilisable et que la synthèse d’une mole d’ATP consomme environ 30 kJ.mol-1, calculer le rendement énergétique de la respiration. Proposer un schéma de synthèse montrant, dans le cadre d’une cellule eucaryote, les différentes étapes de la respiration cellulaire. En prenant en compte la glycolyse, calculer le nombre de molécules d’ATP formées lors de la dégradation d’une molécule de glucose par respiration. La chaîne respiratoire de la membrane interne mitochondriale. La membrane interne des mitochondries contient des complexes d’oxydoréduction formant une chaîne respiratoire. Action du cyanure sur la consommation d’O2. © Spécialité SVT Belin 2012 Le cyanure est un poison qui bloque le transfert des électrons au sein de la chaîne respiratoire. Son effet sur la consommation d’O2 par des levures est analysé. http://lewebpedagogique.com/bouchaud 13Energiecellule5.docx 3 Document de secours. Rôle des mitochondries dans le processus de respiration cellulaire. © Spécialité SVT Bordas 2012 Document de secours. Rôle des mitochondries dans le processus de respiration cellulaire. © Spécialité SVT Bordas 2012 Document de secours. Rôle des mitochondries dans le processus de respiration cellulaire. © Spécialité SVT Bordas 2012 uploads/Industriel/ 13-energiecellule-5.pdf