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Etude expérimentale de la phosphatase alcaline Enzymologie 2 Cabaret Laurine Ma

Etude expérimentale de la phosphatase alcaline Enzymologie 2 Cabaret Laurine Martin Laetitia Groupe C2 01/10/2010 I. Introduction Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d’une enzym d’étudier l’influence de la concentration en substrat et de la présence d’un inhibiteur su vitesse de réaction. Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline d veau. Il s’agit d’une enzyme alcaline à 2 substrats, capable d’hydrolyser les monoester phosphoriques selon la réaction suivante : R-O-PO3 2- + H2O R-OH + HPO4 2- II. Principe Afin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotomét des produits apparus dans le milieu, lorsque l’enzyme est en présence de son substrat. faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate (PNPP qui, après action de l’enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP) directement dosable à 410nm. + H 2O HPO 4 2- + PNPP incolore Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l’absorbance d’une subst colorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d’enregistrem (ordinateur), qui nous permet de visualiser l’évolution de l’absorbance dans un interval temps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâc pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (ΔDO/min). De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gam étalon de tubes contenant différente concentration (connues) de produit. On trace la dr DO = f ([PNP]). En reportant l’absorbance d’une solution de concentration inconnue, on peut en déduire sa concentration. III. Manipulations préliminaires Afin de réaliser la gamme étalon et les milieux d’incubation, nous devons préalablemen préparer les solutions de substrats de concentrations différentes. 1) Solution de PNPP : Nous voulons préparer 6 tubes de solution de PNPP à 2,5 mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,167mM, 0,125mM, à partir d’une solution mère de 5mM. Pour cela, nous effectuons u dilution en cascade. 10mL 8mL 10mL 10mL 13,4mL 5mL 5mM 2,5 mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM [PNPP] (umol /L) 5mM 2,5mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM 0,125mM Solution mère (mL) 20 10 8 10 10 13,4 5 H20 (mL) 0 10 12 10 10 6,6 15 Calcul pour la première dilution : C 1 V 1 = C 2 V 2 V 1 = 20mL Donc V 1 = (C 2 V 2 )/ C 1 V = (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 mL Il faut donc prélever 10mL de la solution mère, et ajouter 10mL d’eau pour la diluer 2 fo 2) Solution de glycérophosphate : Comme précédemment, nous voulons préparer 2 tubes de solution de glycérophosphat 2,5mM et 1mM, à partir d’une solution mère à 5mM. 7mL 4mL 5mM 2,5 mM 1mM [GRO-P] 5mM 2,5mM 1mM Solution mère (mL) 10 7 4 H20 (mL) 0 7 6 Calcul pour la première dilution : C 1 V 1 = C 2V 2 V f1 = 10mL Donc V 1 = ( C 2 V 2)/ C 1 V = (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 mL Il faut donc prélever 7mL de la solution mère et ajouter 7mL d’eau pour la diluer 2 fois. IV. Etude cinétique de la libération du produit 1) Gamme étalon n°1 : Nous préparons la gamme étalon puis nous mesurons la DO dans chaque tube à 410 nm longueur d’onde à laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traçons, ensuite, la droite éta DO corrigée = f (quantité de PNP) CF tableau 1 et figure 1a Calcul de la quantité de produit dans les tubes : n = CV Tube 1: n = 0 µmole Tube 2: n= (0,5.10 -3. 0,025.10 -3)= 0,0125 µmole (C= 6, 25 µmole/ L) Tube 3: n= (0,5.10 -3. 0,05.10 -3) = 0,025 µmole (C=12,5 µmole/ L) Tube 4: n= (0,5.10 -3. 0,1.10 -3) =0,05 µmole (C=25 µmole/ L) Tube 5: n = (0,5.10 -3. 0,15.10 -3) = 0,075µmole (C=37,5 µmole/ L) Tube 6: n = (0,5.10 -3. 0,2.10 -3) = 0,1 µmole (C=50 µmole/ L) 2) Milieux d’incubation : Cf tableau 2 Calcul de [PNPP] dans chaque tube (A à G) : On effectue deux dilutions successives du PNPP: On en ajoute 0,5 mL dans 3,5 mL de m réactionnel, puis on prélève 1,75 mL de ce milieu dans lequel on rajoute 0,25mL d’enzy Première dilution (milieu A) : [PNPP] = (C PNPP .V PNPP ) / V total [PNPP] = (0,125.0,5) / 3,5 = 17,85 µM Deuxième dilution (cuve A): [PNPP] = (C PNPP .V PNPP ) / V total [PNPP] = (17,85.10 -3. 1,75)/2 = 15,6 µM On procède de la même manière pour les autres milieux et on obtient:  [PNPP]B = 20,90 µM  [PNPP]C = 31,25 µM  [PNPP]D = 62,5 µM  [PNPP]E = 124,95 µM  [PNPP]F = 324,71 µM  [PNPP]G= 625,0 µM Calcul de la concentration de l’enzyme dans les milieux réactionnels: C enz V enz = C tube V tube C tube = (0,1 . 0,25)/ 2 = 0,0125 mg/mL = 12,5 µg/mL Maintenant, nous mesurons les variations de la DO dans chaque milieu d’incubation, au cours du temps (3minutes), à l’aide d’un spectrophotomètre et d’un système d’enregistrement. Nous obtenons différentes droites ΔDO = f (t). La pente de chaque d ΔDO/min, représente la vitesse de la réaction, aux temps initiaux, pour une concentrati substrat donnée. Cf tableau 2 figure 2 Commentaire : D’après les courbes obtenues, on peut voir que la DO augmente au cours du temps, et façon linéaire pendant environ 1min. Ce qui signifie que la quantité de produit dans le milieu augmente. De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est importante. Ainsi, la vitesse d’apparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat. Ensuite, pour un temps > 1minute, Il n’y a plus de relation linéaire (pour les milieux A, D, E). En effet, la quantité de substrat dans le milieu, diminue au fur et à mesure de la réaction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit formé donc l’absorbance n’augmen plus de façon linéaire. Pour F et G, on remarque que pour un temps > 1min, la courbe reste linéaire. Effectivem la quantité de substrat est encore suffisante pour que la réaction s’effectue à une vites initiale, maximale. Nous voulons déterminer [PNP]/min, c'est-à-dire la vitesse d’apparition du produit à pa de la pente ΔDO/min. Pour cela, on reporte la valeur de la pente de chaque courbe sur gamme étalon n°1, et on regarde à quelle quantité de produit cela correspond. On obtient : ΔDO/min 0,0126 0,108 0,2646 0,3762 0,3792 0,4128 0,4295 [PNP]/min µmole/L/min 0,62 5,62 17,2 23,12 23,74 25,0 26,25 V. Influence de la concentration en substrat su la vitesse de la réaction 1) Etude graphique de la vitesse de réaction en fonction de [PNPP] : Grâce aux vitesses initiales déterminées précédemment, on trace la courbe de Mickael Menten : Vi = f([PNPP]). Représentation graphique : On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km :  Vmax = 0,411 ΔDO/min Si on reporte cette valeur sur la gamme étalon n°1, on trouve Vmax = 24,9 µmole/min  Km = 23,4 µmole/L Ces valeurs ne sont que des estimations, la représentation de Mickaelis-Menten étant u courbe, il y a une importante marge d’erreur lors de la détermination de Vmax. De plus, le Km est lié à la valeur de Vmax, donc la marge d’erreur se rapporte égaleme valeur du Km. Ainsi, il est nécessaire de linéariser cette représentation, afin de diminuer ces incertitud et obtenir des valeurs beaucoup plus précises. Nous allons donc utiliser les représentat de Lineweaver-Burke, et Hanes-Woolf. 2) Détermination de la vitesse maximale et de la constante de Mickae La cinétique de la réaction suit l’équation de Mickaelis- Menten : la vitesse initiale pour certaine concentration en substrat (PNPP) est de la forme : Et d’après cette équation, on peut en déduire la représentation de Lineweaver – Burke = = + = . + Représentation graphique : Vi = A partir de la représentation de Lineweaver-Burke, on peut en déduire celle de Hanes- Woolf : = . + = . + = [PNPP] . + Représentation graphique : Les représentations graphiques de ces deux relations, sont préférables à celle de Micka Menten, car elles sont linéaires et donc plus précises pour la détermination des constan cinétiques Vmax et Km, d’une réaction enzymatique. On obtient donc les résultats suivant :  Lineweaver-Burke : - Vmax = - Km =  Hanes-Woolf : - Vmax = 27,2 µmole/L/min - Km = 34,42 µmole/L Pour la représentation de Hanes-Woolf, nous avons enlevé le premier point de la courbe il ne correspondait pas au résultat attendu, il faussait la droite. Cf figure 4b et 4b’ 3) Ordre de la réaction : D’après la courbe de Mickaelis-Menten, pour des faibles concentrations en substrat (de 0,3 µM), on a une courbe linéaire.  [PNPP] >> Km donc , V = ( Vm/Km) uploads/Industriel/ pdf-etude-experimentale-de-la-phosphataase-alcaline-enzymologie-2.pdf