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الجمهورية الديمقراطية الشعبية الجزائرية وزارة التعليم العالي والبحث العلمي Peop

الجمهورية الديمقراطية الشعبية الجزائرية وزارة التعليم العالي والبحث العلمي People’s Democratic Republic of Algeria Ministry of Higher Education and Scientific Research Université Benyoucef BENKHEDDA Alger1 Faculté des Sciences Département des Sciences de la Nature et de la Vie (SNV) Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie (SNV) Filière : Sciences Biologiques Spécialité : Master 2 Microbiologie Appliquée Cours Enzymologie et Génie Enzymatique Dr Naïma RAAF Année universitaire : 2022 / 2023 Avant-propos Ce polycopié est destiné aux étudiants en Master 2 microbiologie appliquée. Il a pour objectif d’approfondir les bases de l'enzymologie précédemment acquises et de découvrir les biotechnologies appliquées aux enzymes. Le cours est structuré en trois parties : la première est consacrée à l’enzymologie fondamentale (cinétique enzymatique à un et deux substrats et inhibition enzymatique) ; la seconde aborde l’aspect industriel (production industrielle des enzymes d’intérêt ainsi que leurs domaines d’utilisation) ; et la troisième partie s’intéresse au génie enzymatique (amélioration des propriétés enzymatiques en laboratoire et optimisation de leur utilisation industrielle). La première partie du cours sera complétée par des exercices en TD et une expérimentation en TP. La seconde et la troisième partie seront consolidées par des traitements d’articles qui illustrent des exemples concrets. Etablissement : Université Benyoucef BENKHEDDA Alger1 Faculté: Faculté des Sciences Département : Science de la Nature et de la Vie Public cible : 2ème année Master Microbiologie Appliquée Unité d’enseignement : Méthodologique Intitulé du module : Enzymologie et Génie Enzymatique Crédit : 02 Coefficient : 02 Volume horaire semestriel : 45h (1h30 cours et 1h30 TD / semaine) Modalité d’évaluation : Contrôle Continue 40%, Examen Moyenne Durée 60% Objectifs : Approfondir les bases de l'enzymologie et découvrir les biotechnologies appliquées aux enzymes. Prérequis : Les notions de base de la biochimie, la microbiologie industrielle, la biochimie microbienne et la chimie. Enseignante : Naïma RAAF E-mail : raaf.naima@gmail.com Enzymologie et Génie Enzymatique Dr N. RAAF M2 Microbiologie Appliquée Sommaire Avant-propos0 Introduction générale ........................................................................................................ 1 Chapitre 1: Rappels et notions de base ........................................................................... 3 Chapitre 2: Cinétique enzymatique et activité catalytique ............................................ 10 Chapitre 3: Les enzymes d’intérêt industriel ................................................................ 34 Chapitre 4: Domaines d’utilisation des enzymes .......................................................... 47 Chapitre 5: Production industrielle des enzymes .......................................................... 58 Chapitre 6: Génie enzymatique ..................................................................................... 75 Bibliographie .................................................................................................................. 97 Enzymologie et Génie Enzymatique Dr N. RAAF M2 Microbiologie Appliquée 1 Introduction générale Les enzymes ont joué un rôle important dans plusieurs aspects de la vie depuis l'aube du temps. Celles-ci sont d'une importance vitale pour l'existence de la vie. Les civilisations les ont utilisées pendant des milliers d'années sans connaitre leur nature et comprendre leur fonctionnement. La science a peu à peu déverrouillé le mystère des enzymes et a appliqué les nouvelles connaissances pour mieux les exploiter dans des domaines divers et variés allant de la production alimentaire à la dépollution de l’environnement en passant par la production d’agents thérapeutiques. Durant les XVIIIe et XIXe siècles plusieurs scientifiques comme Lazzaro Spallanzani, Constantin Kirchhoff, Anselme Payen, Jean-François Persoz, Theodor Schwann, Louis Pasteur, Justus von Liebig, Marcellin Berthelot et Wilhelm Kühne rapportent que des composants, des substances ou des molécules sont impliqués dans la transformation de la matière ou les changements chimiques. Contrairement à Louis Pasteur qui pensait que les changements chimiques lors de la fermentation résultent des processus de la vie au sein des levures impliquées dans la fermentation, Justus von Liebig privilégiait une théorie purement chimique impliquant une substance chimique « un ferment » produite par un organisme en décomposition. C’est finalement le chimiste allemand Eduard Buchner qui met fin à cette opposition avec sa découverte qui lui a valu le prix Nobel en 1907. Eduard Buchner s’intéressait aussi aux extraits de levure dans un but thérapeutique. les moyens de conservation étant limités à l’époque, il choisit de les garder précieusement dans du sucre. Il observa que l’adjonction de saccharose entraînait la formation de bulles de gaz carbonique dans le mélange. Le point important fût de vérifier qu’il n’y avait présence d’aucune cellule ou débris membranaires dans les extraits de levure préalablement broyés. En publiant ses observations, Eduard Buchner conclut : « La complexité de la levure n’est pas indispensable au déroulement de ce processus. Le ferment actif du jus n’est probablement qu’une substance dissoute, sans aucun doute une protéine : nous la baptiserons zymase. ». La démonstration fût ainsi faite que la fermentation n’est pas le résultat de « principes occultes vitaux » mais celui d’une succession de réactions biochimiques contrôlées par des catalyseurs biologiques contenus dans les cellules. On sait maintenant que la « zymase » des extraits de levure obtenue par Eduard Buchner est en fait un mélange des enzymes qui catalysent les réactions de la glycolyse. Au début du XXe siècle, de gros efforts furent fournis pour purifier des enzymes, élucider les voies métaboliques et décrire l’activité catalytique des enzymes en termes mathématiques. Des années 20 aux années 50, des centaines d’enzymes furent purifiées et cristallisées, permettant ainsi l’élucidation de nombreuses voies métaboliques. Franz Hofmeister, Victor Henri, Adrian Brown, Leonor Michaelis, Maud Menten, George Briggs, James Haldane, Daniel Koshland, Wallace Cleland, Daniel Koshland, George Nemethy, Ron Laskey et John Ellis ont largement contribué à ces avancés. L’identification des enzymes impliquées dans ces voies métaboliques et l’élucidation Enzymologie et Génie Enzymatique Dr N. RAAF M2 Microbiologie Appliquée 2 des réactions qu’elles catalysent sont à l’origine de nombreux Prix Nobel : Archibald Hill a obtenu le Prix Nobel en 1922 pour la description de la courbe en forme de sigmoïde de fixation du dioxygène sur l’hémoglobine, James Sumner et John Northrop en 1946 pour la cristallisation de nombreuse enzymes, Frédéric Sanger en 1958 pour la mise en évidence de la séquence complète en acides aminés de l’insuline, Jacques Monod en 1965pour le modèle cinétique pour les enzymes allostériques, Christian Anfinsen, Stanford Moore et William Stein en 1972 pour avoir établi la relation structure-fonction de la ribonucléase, Martin Karplus, Michael Levitt et Arieh Warshel en 2013 pour le développement de modèles multi-échelles pour des systèmes chimiques complexes... De nos jours, de nouvelles disciplines viennent compléter les connaissances acquises en enzymologie: la génomique structurale, la génomique fonctionnelle, la métagénomique, l’épigénomique, l’interactomique, la fluxomiquel, la transcriptomique et la protéomique. Le développement de la biotechnologie a ouvert une nouvelle ère d’applications enzymatiques dans plusieurs processus industriels et de recherche. C’est le cas notamment de la biotechnologie blanche qui tend à substituer l’utilisation des bactéries par les enzymes. Cela a abouti à la création de nombreux nouveaux produits mais aussi à l’amélioration de la performance de processus existants. Enzymologie et Génie Enzymatique Dr N. RAAF M2 Microbiologie Appliquée 3 Rappels et notions de base I. Définitions 1. Enzyme Le mot enzyme est emprunté de l’allemand « Enzym », composé du préfixe « en », et du radical du grec « zumê » qui veut dire levain. Les enzymes sont des protéines qui interviennent dans tous les processus de biosynthèse, de dégradation, de régulation et de reproduction et qui accélèrent les réactions métaboliques d’un organisme. Ce sont des catalyseurs qui augmentent la vitesse des réactions chimiques 106 à 1012 fois par rapport aux réactions spontanées. Les enzymes agissent à de toutes petites quantités et chaque enzyme est spécifique d’une réaction. Elles agissent sur le même substrat pour donner le(s) même(s) produit(s), et à la fin de la réaction, les enzymes ne sont pas consommées et sont restituées (Fig.1). Figure 1. Schéma d’une réaction enzymatique 2. Substrat Un substrat est toute molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action catalytique d’une enzyme. 3. Produit Le produit est la molécule qui résulte de la réaction catalysée par une enzyme. 4. Cofacteur Un cofacteur est un élément chimique intervenant obligatoirement dans une réaction enzymatique : - Pour transporter ou compléter un substrat. - Pour accepter un produit. - Comme participant à la structure d’une enzyme. En effet, certaines réactions enzymatiques se produisent simplement entre un substrat et l’enzyme, aboutissant à la formation d’un produit. Mais pour d’autres réactions, un troisième Enzymologie et Génie Enzymatique Dr N. RAAF M2 Microbiologie Appliquée 4 corps chimique est indispensable, c’est le cofacteur (Fig.2). Les cofacteurs peuvent être des ions ou de petites molécules minérales habituellement présentes dans les milieux biologiques. Chaque enzyme reconnaît spécifiquement les cofacteurs dont elle a besoin. Figure 2. Activation d’une enzyme par son cofacteur Certains cofacteurs sont des molécules plus complexes synthétisées par les cellules, ils sont alors appelés coenzymes. 5. Coenzyme Un coenzyme est une molécule biologique intervenant comme cofacteur indispensable dans la catalyse enzymatique d’une réaction. Les coenzymes se divisent en deux types : - Lorsque les coenzymes sont liés à l’enzyme par des liaisons de type électrostatique ou plus faiblement encore, cette liaison est renouvelée à chaque réaction effectuée. La concentration des coenzymes doit être du même ordre de grandeur que celle du substrat (stœchiométrique). Ces coenzymes sont appelés coenzymes libres parce qu’ils se dissocient de l’enzyme à chaque réaction catalysée. - Lorsque au contraire les coenzymes sont liés aux enzymes par des liaisons fortes de type covalente, leur concentration est nécessairement la uploads/Industriel/ polycopie-enzymologie-et-genie-enzymatique-raaf.pdf