Paris 13 UE1 : BIOCHIMIE FICHE DE COURS N°4 : STRUCTURE ET PROPRIETES DES PROTE

Paris 13 UE1 : BIOCHIMIE FICHE DE COURS N°4 : STRUCTURE ET PROPRIETES DES PROTEINES (Thématique abordée en séance 2) › Notion tombée 1 fois au concours ›› Notion tombée 2 fois au concours ››› Notion tombée 3 fois ou plus au concours Nouveauté au programme cette année FC : Structure et propriétés des protéines Page 2 I- STRUCTURE PRIMAIRE DES PROTEINES LA LIAISON PEPTIDIQUE DEFINITIONS Liaison peptidique ›: ¾ liaison covalente (amide, de type CONH) qui est constituée à l’intérieur des cellules lors de la traduction (lecture de l’ARN messager par tout le système complexe de la synthèse des protéines). ¾ Elle s’établit entre la fonction carboxylique d’un AA et la fonction amine d’un autre AA. Peptides : polymères d’acides aminés liés entre eux par une liaison peptidique. ¾ Oligopeptides : – de 10 AAs => dipeptides (2 AAs), tripeptides (3 AAs)… décapeptides (10 AAs). ¾ Polypeptides : > 10 jusqu’à plusieurs dizaines de milliers d’AAs ›, taille moyenne ≃ 1100 Da (taille moyenne d’un AA ≃ 110 Da) ¾ Protéines : polypeptides de taille > 10 kDa. Structure primaire d’une protéine = nombre d’AAs et ordre (séquence) dans lequel ils sont associés les uns aux autres. PROPRIETES La liaison peptidique est plane : ¾ Les électrons des orbitales π sont délocalisés entre les cortèges électroniques des atomes N, C et O (hybridés sp2). ¾ Elle est stabilisée par résonnance = délocalisation des électrons entre 2 formes mésomères (neutre et chargée) Les atomes Cαn, CONH et Cαn+1 sont figés, immobilisés, dans le même plan : ¾ Ceci est dû à la délocalisation d’électrons entre ces atomes ¾ Dans la nature, les conditions qui permettraient une rotation de la liaison peptidique ne se produisent quasiment jamais ›. les atomes N, C, O ne pouvant bouger qu’en bloc, les probabilités de formation de structures différentes, de conformations qu’une protéine peut adopter dans l’espace, sont restreintes. Toutes les liaisons peptidiques mettant en jeu les mêmes atomes, elles représentent des modules de longueurs (distances inter- atomiques) exactement identiques. ¾ La distance entre deux carbones α d’AAs qui se suivent est toujours de 3,6 angströms. La longueur d’une chaîne peptidique est donc : nombre d’AAs x 3,6 Å ›› ¾ La structure des protéines est modulaire parce qu’elles sont constituées de différentes chaines latérales d’AAs mais elle ne peut pas être réalisée de n’importe quelle façon car les liaisons peptidiques ont toutes de la même longueur. Ö la constance des dimensions de la liaison peptidique détermine la structure spatiale des protéines. Les groupements autour des atomes C et N de la liaison sont en configuration trans : Dans cette configuration spatiale, l’encombrement stérique est moindre car les forces de répulsion entre les groupements sont moindres (moins d’interactions stériques entre les chaînes latérales R de carbones α adjacents). NOMENCLATURE 1er AA = NH2 du Cα toujours libre et protonnée (NH3+) = extrémité amino-terminale (N-terminale). Dernier AA = COOH libre (COO-) = extrémité carboxy-terminale (C-terminale). sens d’écriture des protéines = de l’extrémité N-terminale vers l’extrémité C-terminale (= sens de synthèse dans la cellule). Convention d’écriture des protéines : ¾ en écrivant les AAs en entier, avec le code à 1 lettre ou à 3 lettres. ¾ en écrivant les acides aminés avec le suffixe –yl et le dernier AA sans suffixe (ex : Tyrosyl – Alanyl- Sérine) FC : Structure et propriétés des protéines Page 3 ETAPES DU SEQUENCAGE DEFINITION Le séquençage d’une chaîne polypeptidique, c’est déterminer sa structure primaire. Une protéine est formée d’une ou plusieurs chaines polypeptidiques unies par des liaisons non peptidiques (ex : insuline). Structure primaire = nombre d’acides aminés + ordre = séquence des acides aminés. Le séquençage permet en outre d’étudier : ¾ le lien entre la structure primaire d’une protéine et sa structure tridimensionnelle, sa fonction, ses propriétés biologiques ¾ le lien entre la mutation d’un AA et une pathologie SEPARATION ET PURIFICATION DES CHAINES POLYPEPTIDIQUES Si la protéine comprend plus d’une chaîne peptidique (ex : insuline, hémoglobine), il faut les séparer : ¾ Si elles n’étaient pas séparées, des signaux doubles seraient obtenus et il ne serait alors pas possible de savoir à quelle chaîne appartient l’AA identifié. ¾ Pour supprimer les liaisons non-covalentes entre les chaînes, il suffit de modifier la force ionique du milieu ¾ Pour supprimer les ponts disulfures (liaisons covalentes) : 9 ils doivent être réduits (β-mercaptoéthanol, dithiothréitol ›) 9 les thiols réduits (SH) sont très réactifs (ils peuvent se réassocier par oxydation) et doivent être protégés (stabilisés) par alkylation 9 L’alkylation est réalisée par l’iodoacétamide › = molécule très réactive comportant un atome d’iode. Les chaînes séparées et stabilisées peuvent alors être étudiées : ¾ différentes techniques : chromatographies liquide à haute pression (HPLC) en phase inverse, de filtration sur gel ¾ séparation des chaînes en fonction bien souvent de leur taille ¾ analyse des chaînes de manière indépendante. DETERMINATION DE L’EXTREMITE N-TERMINALE La réaction qui permet de déterminer l’extrémité N-terminale est la dégradation d’Edman › = réaction de carbamylation. Elle utilise le phénylthioisocyanate ››, qui possède un atome de carbone déplété en électrons (car il est situé entre un atome de souffre et un atome d’azote) Ce réactif ne réagit qu’avec la fonction amine de l’acide aminé amino-terminal (pas avec celle présente dans certaines chaînes latérales) Æ formation d’une liaison covalente ¾ Le composé forme un dérivé PTC (phényl-thio-carbamylé) = intermédiaire réactionnel ¾ Par un passage en milieu acide, le dérivé PTC devient complètement instable Æ il se décroche et forme une phénylthiohydantoïne, stable, dont la partie variable correspond à la chaîne latérale de l’AA N-terminal qui s’est décroché. La protéine ayant été tronquée de son AA amino-terminal, l’AA qui était initialement en 2ème position devient l’AA N- terminal. ¾ Une nouvelle réaction chimique de dégradation d’Edman peut alors être initiée pour décrocher et identifier le 2ème AA. ¾ La réaction peut ainsi être répétée de façon automatisée (méthode par récurrence) ¾ A chaque étape, une phénythiohydantoïne est formée et identifiée par HPLC. ¾ Le rendement de chaque réaction d’Edman et la réalisation de chaque réaction de manière automatisée nécessitant plusieurs étapes de préparartion de l’échantillon, il n’est pas possible de distinguer le signal obtenu en HPLC du bruit de fond au-delà de la 15ème réaction. La dégradation d’Edman ne peut donc être répétée qu’un quinzaine de fois Æ permet de déterminer les 15 premiers AAs (suffisant pour avoir des infos. sur la protéine). FC : Structure et propriétés des protéines Page 4 LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) EN PHASE INVERSEE (RP HPLC) Elle permet de déterminer chaque phénylthiohydantoïne formée à chaque cycle de dégradation d’Edman. Principe Elle est très utilisée pour purifier une protéine. C’est une méthode séparative, analytique, des acides aminés (PTC) ou des protéines selon leur coefficient de partage : elle permet de séparer les composés d’un mélange pour pouvoir les identifier. Elle est basée sur l’affinité des composés entre 2 phases : ¾ phase stationnaire apolaire ›: 9 résine composée de petites billes de silice sur lesquelles sont greffés des chaînes hydrogéno-carbonées (CH2-CH2-…-CH3). 9 longueur des chaînes apolaires : C8 et C18 (+ la chaîne est longue, + la phase stationnaire est apolaire). 9 colonnes (préparatives) utilisées : cylindriques, métalliques, capables de supporter des pressions très importantes, de tailles variables en fonction des composés à séparer. 9 Les AAs (PTC) ou les chaînes protéiques, introduits à haute pression dans la colonne, réagissent avec la résine ¾ phase mobile polaire : mélange de solvants organiques polaire (méthanol + acétonitrile) ¾ quand un mélange d’AAs est appliqué sur une colonne contenant la résine, ceux-ci se lient aux billes par des interactions hydrophobes (avec C8 ou C18) Elution : ¾ les acides aminés (PTC) ou les chaînes protéiques sont élués de la colonne + ou - vite selon leur coefficient de partage ¾ le suivi de l’élution de chaque composé du mélange initial est réalisé par un suivi de la concentration de chaque fraction qui sort de la colonne (récupérée dans des tubes en verre). Les conditions opératoires peuvent être modifiées de façon à obtenir une meilleure séparation des fractions. Interprétation des résultats Les phénylthiohydantoïnes obtenus après chaque cycle de dégradation d’Edman sont détectés Obtention de plusieurs pics (chaque pic = 1 AA ou un PTC) après étalonnage, tel temps de sortie = tel AA (ex : 7 min = Met) les pics « fantômes » correspondent à la sortie de phénylthiohydantoïnes correspondant aux AAs précédents. IDENTIFICATION DE LA PROTEINE APRES SEQUENCAGE DE SES PREMIERS ACIDES AMINES Après plusieurs cycles de dégradation d’Edman ou spectrométrie de masse (technique de séquençage plus sensible, permettant de traiter plusieurs centaines de protéines simultanément), la séquence des premiers AAs de la protéine peut être entrée dans différents logiciels. Le logiciel BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) du site NCBI (National Center for Biology Information) recherche rapidement la protéine la plus proche uploads/Ingenierie_Lourd/ fiche-cours-medisup.pdf

Tags
Ingénierie protéines structure question protéine liaisons
Documents similaires
  • 25
  • 0
  • 0
Afficher les détails des licences
Licence et utilisation
Gratuit pour un usage personnel Attribution requise
Partager