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1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés /

1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 15 Observation microscopique de la cellule : Techniques de préparation des échantillons pour microscope électronique (ME) Le microscope électronique, par son pouvoir de résolution très élevé, est un instrument de choix pour visualiser les détails de structure les plus fins (ultrastructure). Néanmoins, les échantillons sont soumis à plusieurs contraintes au cours de l’observation : - L'impact du faisceau électronique, - L'observation dans une chambre à vide, - Échantillon doit être mince afin que le faisceau d’électrons puisse être transmis (MET). - Pour que les échantillons ne soient pas dégradés durant l'observation, ils doivent passer par une étape de préparation qui détermine en partie la qualité des résultats obtenus. - L’échantillon préparé pour ME est placé sur des grilles porte objet de cuivre (Figure 1), au lieu de lame en verre comme pour le MP. -Plusieurs méthodes de préparation d’échantillon et de coloration (ou contraste) sont possible en ME (Figure 2) Figure 1. Grille de cuivre pour ME (le diamètre des grilles est de 3 mm) Figure 2. Préparation de l’échantillon en ME I. Techniques des coupes histologiques Comme déjà vu en MP, la technique des coupes histologiques est aussi applicable pour le MET. La technique passe par les mêmes étapes avec certaines différences : 1. la fixation se fait par le glutaraldéhyde ou le tétroxyde d’osmium qui sont des aldéhydes très réactifs. Le choix du fixateur dépend de la nature et la dimension du spécimen (échantillon). Préparation de l’échantillon (I). Technique des coupes histologiques ultrafines (II). Technique des répliques (cryodécapage) (III). Coloration négative (IV). Ombrage 1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 16 2. la déshydratation : se réalise par des passages successifs dans des bains d’alcool ou d’acétone à degrés croissants. La déshydratation doit être la plus courte possible afin de réduire le rétrécissement et l'extraction des composants tissulaires au minimum. 3. l’imprégnation remplace progressivement le solvant par le milieu d’inclusion. Contrairement à la paraffine utilisée en MP, cette étape se fait dans la résine telle que les résines époxydes l’épon ou l’araldite, ces résines résistent au bombardement électronique du microscope. 4. l’inclusion permet d’enrober l’échantillon dans le milieu d’inclusion de façon à pouvoir confectionner une gélule à couper. 5. la coupe en ME s’effectue sur un ultramicrotome et permettant d’obtenir des coupes ultrafines de 300 à 600A°. Les coupes sont récupérées sur des grilles en cuivre résistant au passage d’électrons. 6. Contraste : en ME les contrastants remplacent les colorants, ce sont des sels des métaux lourds opaques aux électrons comme l’acétate d’uranyle, le citrate de plomb ou le nitrate d’argent qui colore le pourtour de l'objet (on parle aussi d’une coloration positive). A l’observation au MET, l’image recueillie sur l’écran fait apparaitre des zones claires (correspondant à des structures qui permettent la transmission des électrons) et des zones sombres ou dense (correspondant à des structures opaques aux électrons) (Figure 3). Figure 3. Image de l’ultrastructure d’une cellules eucaryote obtenue par MET et réalisée par la technique des coupes ultrafines II. Techniques des répliques (cryodécapage) -Cette technique permet de réaliser une empreinte topographique (réplique) après fracture d’un échantillon congelé. Elle permet l’obtention d’une simple ou d’une double réplique (moulage des deux faces de la fracture). -Elle est applicable pour les tissus mais aussi pour les organites isolés ; -Elle est généralement applicable au MEB et s’effectue en 3 étapes : la congélation de l’échantillon, la cryofracture et l’obtention des répliques (Figure 4). 1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 17 a. Congélation est un processus de fixation très rapide pratiqué dans l’azote liquide (à - 200°C) qui assure une bonne conservation de la moindre petite structure cellulaire. b. Cryofracture se réalise dans une enceinte à vide grâce à une lame métallique portée à la surface de l’échantillon ; ce dernier étant surgelé devient très cassant et la ligne de cassure tend à suivre les zones de moindre résistance qui sont précisément les surfaces internes des membranes. c. Décapage par sublimation assure une évaporation de l’eau de la surface de la fracture ce qui a pour intérêt d’accentuer les irrégularités superficielles. d. Ombrage correspond à une première vaporisation verticale d’une mince couche de carbone : c’est la réplique carbonée. Cette dernière est ombrée avec une deuxième vaporisation oblique de platine, ce qui fait ressortir les détails superficiels en produisant un effet d’ombre. On obtient ainsi une empreinte (moulage) de la surface de fracture. e. Réplique obtenue est retirée de l’enceinte sous vide par dissolution du support organique à l’aide d’un acide (acide sulfurique ou chlorhydrique). À l’observation de la réplique au MEB, l’image observée révèle des reliefs et des dépressions (Figure 5) Figure 5. Image obtenue après cryodécapage et observée au MEB 1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 18 Figure 4. Technique de réplique ou cryodécapage 1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 19 III. Coloration négative Le contraste ou la coloration négatif s’applique à des objets de très petites dimensions, de forme relativement simple et mise en solution (molécules, virus ou éléments cellulaires isolés : organites ou fragments d’organites). Elle permet de voir, en MET, des détails macromoléculaires que les coupes ne permettent pas de visualiser. Dans cette technique, on place une goutte de colorant (acétate d’uranyle ou acide phosphotungstique de potassium) sur une grille qui porte les particules à étudier (Figure 6). À cause de la tension superficielle, le colorant à tendance à envelopper la particule pénètre dans toutes les irrégularités qui s’ouvrent à la surface de la particule sans pénétrer à l’intérieur. De par sa forte masse atomique, le contrastant dévie les électrons (dense aux électrons) ; ainsi l'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure, d'où le nom de coloration négative. L'échantillon apparaît, au MET, blanc sur un fond sombre sur les photographies qui produisent une impression d’image en trois dimensions (3D) (Figure 6). Figure 6. Technique de Coloration négative en (A) et image de particule virale du coronavirus en (B) et du Bactériophage en (C) A B C 1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 20 IV. Ombrage métallique Comme pour la coloration négative, la technique de l’ombrage métallique s’applique pour rendre visible de très petites particules isolées (biomolécules, constituants cellulaires, virus ou bactéries). Les grilles sont placées dans une chambre fermée sous vide, Dans la chambre se trouve un filament composé d’un métal lourd (généralement le platine) avec du carbone. Le filament est porté à haute température, ce qui provoque son évaporation et le dépôt d’un revêtement métallique sur toutes les surfaces accessibles dans la chambre (Figure 7). Le métal se dépose donc sur les surfaces qui font face au filament, tan disque les surfaces opposées de l’objet, qui sont dans l’ombre, restent non revêtues et incapable de diffracter les électrons. Par conséquent, les zones qui sont dans l’ombre sont éclairées sur l’écran, alors que les régions couvertes de métal sont foncées. Cette technique donne un très bon contraste pour un matériel isolé et produit une impression d’image en trois dimensions (3D) (Figure 8 et 9). Figure 7. Technique de l’ombrage métallique 1ière Année SNV (2020-2021) / Module de Biologie cellulaire / Travaux dirigés / TD N 5 21 Figure 8. Fibre de chromatine en (A) des nucléosomes en collier de perle en (B) observés par MET et un ombrage métallique effectué sur une paroi végétale (charpente cellulosique) en (C). Conclusion : complétez le paragraphe Pour l’étude en microscopie, qu’elle soit photonique ou électronique, les tissus sont généralement ……………, ………………, puis colorés ou ……………….. L’étude de cellules isolées au MP (cellules sanguines, bactéries) ……………………… de coupes mais peut être réalisée sur …………………….. Pour visualiser l’intérieur des membranes cellulaires, on aura recours à la technique ……………………………………… observés au ……………………. Les macromolécules ou particules isolées peuvent être visualisées après ……………………………. ou ………………………….. A B C uploads/Ingenierie_Lourd/ le-diametre-des-grilles-est-de-3-mm.pdf