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I. Préparation de la solution BSA de palmitate de sodium 1. Palmitate de sodium

I. Préparation de la solution BSA de palmitate de sodium 1. Palmitate de sodium 1 mM / solution de BSA 0,17 mM (rapport molaire 6: 1 palmitate: BSA) Remarque: Le maintien de températures spécifiques pour toutes les solutions est essentiel pour obtenir une conjugaison de qualité 2. Eau chaude de 200 ml d'eau du robinet dans deux béchers séparés 1L, maintenus dans un bain d'eau de 37 ° C 3. Réchauffer un bêcher de 250 ml avec une barre d'agitation dans un incubateur de 37 ° C 4. Préparez 300 ml d'une solution de NaCl 150 mM en ajoutant 9 ml de stock 5M à 291 ml de dH2O II. Préparation de la solution BSA (100 ml) Note: La moitié de la solution de BSA préparée est conjuguée avec le palmitate de sodium, la moitié restante est utilisée pour préparer les differentes parties pour le véhicule témoin 1. Peser 2.267 g BSA sans acides gras 2. Ajouter 100 ml de solution de NaCl 150 mM dans le bécher préchauffé de 250 ml avec une barre d'agitation et placer sur une plaque d'agitation 3. Ajouter la BSA au bécher en remuant constamment 4. Placez un bécher pré-réchauffé 1L avec de l'eau du robinet sur une plaque d'agitation chauffée et placez un thermomètre dans le bain d'eau 5. Couvrir le bécher contenant la solution de BSA avec parafilm et la placer dans le bain marie 1L 6. Réglez la chaleur au besoin pour maintenir la température à environ 37 ° C mais pas supérieure à 40 ° C 7. Remuer jusqu'à ce que la BSA soit complètement dissoute 8. Transférer la solution BSA dans la chambre d'une unité de 150 ml dans une hotte laminaire 9. Filtrer avec un aspirateur 10. Transférer 50 ml de la BSA filtrée dans un bécher préchauffé de 250 ml, la couvrir avec parafilm et la placer dans le bain d'eau, reprendre l'agitation 11. Diluer la solution de BSA restante avec 50 ml de solution de NaCl 150 mM, pour obtenir 0,17 mM 12. Aliquote dans des flacons de verre de 4 mL et congéler à -20 ° C pour une utilisation ultérieure comme contrôle du véhicule III. Préparation de la solution Palmitate 1. Pendant que la BSA est agitée dans le bain-marie, peser 30,6 mg de palmitate de sodium et l'ajouter à 44 ml d'une solution de NaCl 150 mM dans un Erlenmeyer de 50 ml, avec une barre d'agitation 2. Couvrez l'erlenmeyer avec parafilm et faites-le peser 3. Placez l'autre bécher pré-réchauffé 1L avec de l'eau du robinet sur une plaque d'agitation chauffée et placez le thermomètre dans le bain-marie 4. Placez l'erlenmeyer av le palmitate dans le bain d'eau, et chauffez à 70 ° C tout en remuant Remarque: La solution Palmitate peut devenir trouble entre 50-60 ° C. Il deviendra clair car il atteint près de 70 ° C. IV. Conjugating Palmitate and BSA 1. Retirez le parafilm du bécher avec BSA et de l'erlenmeyer av palmitate 2. Transférer 40 ml de la solution de Palmitate à 70 ° C dans la solution BSA tout en agitant à 37 ° C (transférer 5 mL à la fois de palmitate dans une pipette de 10 ml, aspirer et distribuer rapidement) 3. Couvrez le bécher avec parafilm 4. Mélanger à 37 ° C pendant 1 heure, surveiller la température du bain d'eau pour garder entre 35 ° C et 40 ° C Remarque: Ajoutez de la glace au bain-marie pour abaisser la température si elle approche à 40 ° C 5. Réglez le volume final à 100 ml dans un cylindre gradué en verre avec 150 mM de NaCl Note: Ceci crée une solution de travail à 1 mM Palmitate-conjugate 6. Vérifiez le pH et ajustez-le à 7,4 avec NaOH 1 N 7. Préparez des aliquotes de 4 ml dans des flacons en verre et géluez à -20 ° C Remarque: Le palmitate-BSA est stable pendant au moins deux mois lorsqu'il est stocké correctement à -20 ° C uploads/Marketing/ protocole-bsa-palmitate-en-melange.pdf