Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

DOCUMENTS AFFÉRENTS TRAVAUX PRATIQUES DE BACTÉRIOLOGIE VÉTÉRINAIRE Dans la cadr

DOCUMENTS AFFÉRENTS TRAVAUX PRATIQUES DE BACTÉRIOLOGIE VÉTÉRINAIRE Dans la cadre du cours d’Infectiologie vétérinaire DMV 2120 FACULTÉ DE MÉDECINE VÉTÉRINAIRE UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL C.P. 5000, SAINT-HYACINTHE, QUÉ. 2 TABLES DES MATIÈRES PAGE Règles à suivre au laboratoire 3 Prélèvements de spécimens 4 Guide abrégé d’identification bactériologique 6 Description des tests microbiologiques 13 Charte d’interprétation des antibiogrammes 24 Coloration de GRAM 26 Les milieux de culture spéciaux 28 Méthodes de travail 31 3 RÈGLES À SUIVRE AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE Le laboratoire de microbiologie exige une tenue exemplaire. Les manipulations doivent y être effectuées avec grand soin, gardant à l'esprit le danger toujours présent qu'entraîne l'utilisation de cultures microbiennes. Voici quelques règles que tout(e) étudiant(e) sérieux(se) devrait suivre, dans son intérêt, comme dans celui de ses confrères et consoeurs. 1. Le port du sarrau est de rigueur. Il devra toujours être propre et autant que possible, n'être utilisé qu'au laboratoire de microbiologie. 2. Ne jamais oublier de se laver les mains avant et après chaque séance de laboratoire. 3. Désinfecter les tables avant et après chaque période de travaux pratiques. 4. L'étudiant(e) aux cheveux longs verra à les attacher surtout lors d'un travail exigeant l'emploi d'un bec à gaz. 5. Éviter de porter ses doigts ou tout objet à sa bouche. Ne pas manger ou fumer au laboratoire. 6. Aviser immédiatement le professeur de tout accident (bris de verre, blessures, etc.). 7. Les instruments de travail contaminés ne seront déposés sur la table qu'après avoir été stérilisés par un flambage adéquat. 8. Éviter de laisser les brûleurs allumés inutilement afin de conserver une température ambiante confortable. 9. Afin d'éviter les contaminations extérieures, ne rien transporter hors du laboratoire (local 2964) sans autorisation. 10. Pendant les travaux pratiques, éviter de parler, notamment lorsque des ensemencements sont faits; éviter également de se déplacer inutilement. 11. Déposer tout matériel qui n'est plus utile, dans les récipients destinés à cette fin. 12. Étiqueter soigneusement les cultures avant de les porter à l'étuve. 4 PRÉLÈVEMENTS DE SPÉCIMENS 5 RÈGLES À SUIVRE LORS DE PRÉLÈVEMENTS DE SPÉCIMENS -Les spécimens doivent être prélevés du site (périphérie) de la lésion le plus tôt possible après le début de la maladie; -Les spécimens doivent provenir d’un animal vivant sinon le plus tôt possible après sa mort; -Il est important de prélever les spécimens aussi aseptiquement que possible pour éviter que des contaminants masquent la présence d’un pathogène significatif; -Il faut toujours effectuer le prélèvement avant de débuter le traitement aux antibiotiques; -Les spécimens doivent être mis dans des contenants individuels imperméables, bien identifiés et avec la date du prélèvement; -Lorsque le délai entre le prélèvement et la réception du spécimen au laboratoire se prolongera, il faut prévenir la dessication du spécimen soit en utilisant un milieu de transport dans le cas d’un écouvillon, soit en prélevant une plus grande quantité de matériel pathologique ou en envoyant un morceau de tissu d’au moins 4cc; de plus, le spécimen devra être gardé à 4C mais non congelé. 6 Guide abrégé d'identification bactériologique 7 ISOLEMENT DE BACTÉRIES USUELLES À PARTIR DE SPÉCIMENS Délai Procédure Jour 0 Soumission des spécimens Frottis direct coloré au Gram, Ensemencement sur gélose au sang (et McConkey si nécessaire) Lecture Jour 1 Culture pure Culture mixte Coloration au Coloration au Gram (colonies ) Gram (colonies) Jour 2 Identification Repiquage sur sang et antibiogramme gélose au sang et/ou si nécessaire MacConkey Jour 3 ou plus Identification et antibiogramme si nécessaire 8 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE SALMONELLA Délai Procédure Jour 0 Soumission des spécimens (fèces, tissus, ...) Milieu d'enrichissement (bouillon sélénite) (24 heures à 37°C) Milieu sélectif (gélose SS) Jour 1ou 2 colonies lactose - colonies lactose + (≠Salmonella spp.) Jour 2 ou 3 TSI → autres patrons (≠Salmonella spp.) TSI suspect → pente: alcaline culot: acide } utilisation du glucose seulement H2S: + gaz: + hydrolyse de l'urée + (≠Salmonella spp.) - agglutination au sérum anti-Salmonelle + - test supplémentaires‡ (≠Salmonella spp.) Jour 3 ou 4 ou 5 Identification avec le système d'identification API 20E® et antibiogramme (si nécessaire) 9 ISOLEMENT DE BACTÉRIES ANAÉROBIES Délai Procédure Jour 0 Soumission des spécimens Frottis direct coloré au Gram Ensemencement de gélose réduite en oxygène Anaérobiose, 37°C (peut varier) pendant 48 heures Jour 2 Lecture et repiquage en aérobiose, en anaérobiose et en CO2 24 - 48 heures Jour 3 - 4 Éliminer les anaérobies facultatifs Jour 4 Identification des anaérobies stricts . coloration de Gram . bile . indole . sensibilité aux agents antibactériens . micro-système d'identification pour les anaérobies (API 20A®) Jour 6 - 8 Résultats 10 CLÉ D'IDENTIFICATION DE BACILLES À GRAM POSITIF - Croissance aérobie + + SPORE - + SPORE - Clostridium spp. Lactobacillus spp. Bacillus spp. Corynebacterium spp. Eubacterium spp. Erysipelothrix spp. Propionibacterium spp. Listeria spp. Mycobacterium spp. Actinomyces spp. Lactobacillus spp. Dermatophilus spp. Rhodococcus spp. Arcanobacterium spp. 11 CLÉ D'IDENTIFICATION DES BÂTONNETS À GRAM NÉGATIF, AÉROBIES ET ANAÉROBIES FACULTATIFS TEST D'OXYDASE + - Enterobacteriaceae Acinetobacter spp. Utilisation du glucose (TSI et/ou tube O/F) Oxydation Fermentation Inerte Pseudomonas spp. Mobile Non-mobile Alcaligenes faecalis Moraxella spp. Bordetella spp. Aeromonas spp .Pasteurella spp.* Vibrio spp. Actinobacillus spp.* * fermentation faible 12 OBTENTION DE RéSULTATS À LA CULTURE APRES SOUMISSION D'UN SPECIMEN (jour 0) AU LABORATOIRE DE DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE La recherche de ces micro-organismes doit être indiquée sur le rapport de bactériologie Temps minimum Temps maximuma Moisissures 5 jours 3 sem. Leptospires 5 jours 4 sem. Mycoplasmes 5 jours 2 sem. Uréplasmes 2 jours 1 sem. Brachyspira hyodysenteriae 2 jours 6 jours Anaérobies 2a jours 8 jours "Haemophilus somnus " 2 jours 1 sem. Haemophilus spp. 2 jours 1 sem. Actinobacillus pleuropneumoniae 1 jour 3 jours Salmonella spp. 3 jours 5 jours Listeria spp. 2 jours 6 sem. Yersinia spp. 3 jours 6 sem. Campylobacter spp. 2 jours 5 jours Hémoculture 2 jours 1 sem. ____________________ a absence de croissance Pour certaines espèces bactériennes (Actinobacillus pleuropneumoniae, Escherichia coli, Salmonella spp. et Streptococcus suis) on peut effectuer également des analyses additionnelles de typage. Ces résultats sont obtenus de 7 à 14 jours à partir de la date d'envoi de l'isolat au laboratoire de référence. 13 Description des tests microbiologiques 14 TESTS MICROBIOLOGIQUES POUR IDENTIFICATION BACTÉRIOLOGIQUE 1. Agglutination rapide sur lame 2. Test de CAMP 3. Catalase 4. Citrate 5. Test d'agglutination au latex (PathoDxTM) 6. Coagulase a. en tube b. sur lame 7. Esculine 8. Fermentation des sucres 9. Indole 10. Mobilité 11. Oxydase 12. Oxydation-Fermentation (OF) 13. Phénylalanine Désaminase (PD) 14. Triple Sugar Iron (TSI) 15. Uréase 1. Agglutination rapide sur lame (pour confirmation de l'identification d'un Salmonella) L'agglutination est une réaction entre des cellules entières de micro-organismes et des agglutinines. Les agglutinines sont des anticorps pouvant provoquer des agglomérations de cellules. Se fixant à la surface des bactéries ou des cellules qui ont induit leur production, elles agissent comme agents de pontage entre celles-ci et les agglutinent. Les agglutinations ainsi produites se voient à l'oeil nu. Technique - A partir d'une colonie, transférer, à l'aide d'anse de platine, un inoculum à deux endroits sur une même lame de verre. - Sur l'un d'eux ajouter une goutte de saline et sur l'autre ajouter l'antisérum. - A l'aide d'un bout de bâtonnet de bois, bien mélanger la saline et l'inoculum. Si cette suspension bactérienne est bien homogène, non auto-agglutinante, bien mélanger l'antisérum et l'inoculum et observer la présence d'agglutination. 15 2. Test de CAMP Principe Déterminer si un organisme synthétise le facteur CAMP qui agit en synergie avec l'hémolysine B du staphylocoque, ce qui produit une lyse complète des érythrocytes à la jonction des deux organismes. Technique - Sur une gélose au sang, faire une strie de Staphylococcus aureus avec le fil de platine. Faire une deuxième strie avec la culture à identifier, de façon à ce qu'elle soit perpendiculaire à celle du Staph. aureus. Cette deuxième strie ne doit pas toucher la première, tout en étant très proche. Plusieurs cultures peuvent être soumises à l'épreuve sur la même gélose. Incuber à 37°C jusqu'au lendemain. Résultats Réaction positive: zone typique d'hémolyse complète en forme de pointe de flèche, à la jonction des deux stries. Réaction négative: aucune augmentation de l'hémolyse à la jonction des deux stries. 3. Catalase Principe Démontrer la présence de l'enzyme catalase. Technique - A l'aide d'une anse de platine, transférer à partir d'une gélose au sang, une partie d'une colonie si les colonies sont moyennes et plus d'une colonie si les colonies sont petites. Il faut parfois en prendre plus qu'une (sans gélose au sang car le sang contient de la catalase et donne une réaction positive) sur une lame de verre propre. - Ajouter une goutte de peroxyde d'hydrogène (H2O2, 30%) sur la colonie placée sur la lame. Interprétation Réaction positive: effervescence (bulles de gaz) immédiate dans le peroxyde. Réaction négative: absence d'effervescence dans le peroxyde. 16 4. Citrate Principe Déterminer si la bactérie peut utiliser le citrate comme seule source de carbone. Technique (milieu de Simmons) A partir d'une croissance sur gélose, à l'aide d'une anse de platine, faire un prélèvement peu abondant afin d'inoculer uploads/Science et Technologie/ dmv2120-travaux-prat.pdf