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Filière SVI - S6 Module de Génétique et Biologie Moléculaire – M21 Elément 2: B

Filière SVI - S6 Module de Génétique et Biologie Moléculaire – M21 Elément 2: Biologie Moléculaire – Pr. Bouchra BELKADI Partie 1: Biologie Moléculaire Microbienne Faculté des Sciences - Rabat Année universitaire 2009 - 2010 Pr. Bouchra BELKADI * les macromolécules * les complexes macromoléculaires de l’ADN, l’ARN et des protéines * la réplication, la transcription, la traduction Biologie Moléculaire ? Etude des gènes portant l’information génétique et leurs transformations Comment a-t-on pu procéder à ces études ? Grâce à la technologie de l’ADN recombiné ou génie génétique, qui permet : • de prélever un fragment spécifique d’ADN • de manipuler ce fragment dans un tube à essai • de le remettre dans un organisme (le même ou un autre) Production de fragments d’ADN Liaison de ces fragments à un support moléculaire (= vecteur) Introduction du vecteur dans une cellule hôte pour en faire de multiples copies (= pour l’amplifier) Sélection du fragment que l’on veut étudier Ex. de découvertes réalisées grâce aux bactéries: - Recombinaison intragénique ; - Réplication de l’ADN ; - Code génétique ; - La régulation (opéron) ; - Les enzymes de Biologie Moléculaire : Enzymes de restriction, Ligases, Polymérases (ADN et ARN), Polymérases thermostables (PCR), etc.. Quelles sont les conséquences du développement de la biologie moléculaire ? • des connaissances dans le domaine fondamental • des applications pratiques : - production de protéines d’intérêt médical - vaccins - diagnostic en médecine - plantes et animaux transgéniques… Les 3 domaines du vivant Archaea Gram positif Cyanobacteria Proteobacteria Plantes Fungi Animaux Sulfolobus Méthanogènes Halophiles I- Introduction Les 3 domaines du vivant EUCARYOTE PROCARYOTE Procaryotes ou Bactéries Deux grands groupes, les eubactéries et les archaebactéries avec des fonctionnements différents au niveau moléculaire mais une organisation similaire Structure:  Petite taille généralement (avec des exceptions)  Leur structure est très simple, le plus souvent sans cytosquelette ni réseau de membrane interne  Présence d'une paroi complexe  Dans le cytoplasme, il y a présence des ribosomes et d'une masse "plus claire", le nucléoïde qui contient l'ADN sous forme d’un ou quelques chromosomes ( svt circulaire)  Par scissiparité (fission binaire): 1 cellule donne par division 2 cellules filles génétiquement identiques (notion de clone)  Pas d'individualisation de chromosomes visibles en cytologie à aucun moment de leur cycle de vie Procaryotes ou Bactéries Division binaire:  Multiplication exponentielle: Xn = 2n X0 X0 : nombre de cellules au départ Xn: nombre de cellules obtenues à un temps donné n: nombre de divisions ou de générations 0 min 20-30 min 2 cellules filles identiques cellule mère 109 bactéries/ ml 18 heures de croissance  Temps de Génération : 20 min (E.coli) dans des conditions optimales à quelques heures  Taux de croissance : 2 divisions / h ou moins  Echange génétique se fait par transferts horizontaux (transformation, conjugaison, transduction…)  Très diversifiées et présentes dans TOUS les milieux et Biotopes  Adaptation rapide à diverses conditions et divers environnements  Des plus dangereuses (pathogènes) au plus utiles et exploitables: Biotechnologies Deinococcus radiodurans 2- Les éléments génétiques non chromosomiques, principaux processus d’évolution rapide des bactéries - Les plasmides - Les transposons Les éléments génétiques dans une cellule Recombinaison génétique: échange physique de gènes entre les éléments génétiques (chromosome, plasmide..) (Recombinaison homologue : échange réciproque entre une paire de séquence homologue d’ADN entre cellule donneuse et receveuse) 1- Le chromosome porte les gènes essentiels à la croissance Trois principaux mécanismes d’échange génétique chez les bactéries 1- Transformation Bactérie + ADN libre 2- Conjugaison Bactérie + bactérie 3- Transduction Bactérie + bactériophage Bactérie réceptrice Exemple de découvertes réalisées grâce aux bactéries:  Recombinaison intragénique ;  Réplication de l’ADN ;  mRNA ;  Code génétique ;  La régulation (opéron) ;  Les enzymes de Biologie Moléculaire : Enzymes de restriction, Ligases, Polymérases (ADN et ARN), Polymérases thermostables (PCR), etc.. Objectifs : - Définir un plasmide ? - Préciser les propriétés biologiques codées par les plasmides ? - Les conséquences médicales de ce type de transfert ? - définir la transposition et le transposon ? I- Introduction Définition Caractéristiques générales Structure et organisation II- Méthodes d’étude: extraction, purification et curage des plasmides (TD) III- Propriétés des plasmides IV- Différents types de plasmides et rôles biologiques A- Les Plasmides B- Les transposons A- Les Plasmides Plasmides Milliers pb I- Introduction Chromosome bactérien circulaire 4millions pb Bactérie En général circulaire, le nombre de copies par cellule peut varier de 1 à quelques centaines. A- Les Plasmides 1- Définition:  Molécules d’ADN double brin libres le plus souvent circulaire, à localisation extra- chromosomique, à capacité de réplication autonome et procure un avantage sélectif.  Ils possèdent plusieurs propriétés conférant aux bactéries une meilleure adaptation à l’environnement.  Ils sont porteurs de gènes non essentiels mais utiles et donc non indispensables au métabolisme normal de la cellule hôte.  Leur transmission naturelle au cours des divisions cellulaires est stable et se fait habituellement par conjugaison. 2- Caractéristiques générales: Présents chez la plupart des espèces bactériennes:  Tailles très variables entre 1Kb à 1 mégabase (généralement inférieures à 5% de celle du chromosome)  ADN double brin Superhélicale avec 3 formes: 3- Structure et organisation: Forme I: CCC: Circular Covalently Closed (circulaire, covalemment fermé) Forme II: OC: Open Circular ( circulaire relâché, un des 2 brins coupé) Forme III: Linéaire (2 brins coupés) Différentes formes des plasmides II- Méthodes d'études des plasmides : TD III- Propriétés des plasmides: Les plasmides sont des associations modulaires de gènes regroupés en unités fonctionnelles. • Ils comportent une zone obligatoire de réplication: Réplicon. Réplication du plasmide indépendante de celle du chromosome Petit nombre de copies/ cellule (1 à 3) = Plasmide Stringent / Réplication stringente. Grand nombre de copies/ cellule (20 à 2000) = Plasmide relâché / Réplication relâchée • Ils peuvent comporter aussi:  Une région de transfert (opéron tra) chez les plasmides conjugatifs codant pour: pili et protéines de conjugaison  Des éléments génétiques mobiles ou non (IS, Tn, Int)  Gènes divers (résistance aux antibiotiques, etc…) 1: Gène codant la résistance à un antibiotique 2: Gènes de transfert (Tra) 3: Origine de réplication Schéma d'un plasmide III- Propriétés des plasmides:  Les plasmides peuvent coder pour diverses fonctions Quelques plasmides célèbres:  Facteur R: Plasmides de résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds (conjugatifs le plus souvent)  Facteur F: (fertilité) Prototype du gros plasmide conjugatif à petit nombre de copies, capacité de synthèse de Pili sexuels chez la bactérie dite F+ ou Hfr par rapport à F- (absent de la cellule)  pBR322: Vecteur de clonage très utilisé aux premier temps du clonage et du génie génétique  Plasmides cryptiques: aucun rôle connu IV- Type de plasmides et rôles biologiques 1- Les gènes impliqués dans la réplication 2- Les gènes de transfert: Plasmides conjugatifs 3- Les gènes conférant des propriétés supplémentaires à la cellule hôte V- Gènes codant différentes fonctions  Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la même cellule, car leur réplication est soumise au même système de régulation donc >>> ils sont fortement apparentés structuralement d’où présence de fortes homologies ADN/ADN  Ces plasmides sont ainsi classés en groupe d’incompatibilité ou groupe Inc. V 1- Les gènes impliqués dans la réplication : La fonction ori : c’est l’origine de la réplication (initiation), elle est responsable du contrôle du nombre de copies d'un même plasmide présent dans une bactérie. Ce système de régulation est à l’origine du phénomène d’incompatibilité V 2- Les gènes de transfert, Plasmides conjugatifs:  Un plasmide conjugatif est autotransférable d’une bactérie mâle à une autre femelle par conjugaison.  Sa taille est supérieure à 30 kb, chez Escherichia coli 90 kb , dont 30 à 50 kb pour les gènes nécessaires au transfert conjugatif.  Ces plasmides sont en faible nombre de copies de 1 à 3 par cellule. Principaux éléments des plasmides conjugatifs L’opéron tra code pour les pili sexuels et pour les protéines nécessaires à la conjugaison. Rôle très important dans la dissémination de l’information génétique et particulièrement des gènes de résistance aux antibiotiques. 1- Reconnaissance entre donneur (F+) et accepteur (F-) grâce à la synthèse du pili (tube creux) 2- Transfert d'un des deux brins du plasmide 3- Synthèse du brin complémentaire chez l'accepteur 4- Re circulisation du plasmide chez l'accepteur Le transfert entre les organismes donneur et accepteur de plasmide se fait en 4 grandes étapes : Conjugaison F+ X F-  2 F+ Transferts d'ADN par conjugaison Grace à la présence des séquences IS (Insertion séquences), le facteur F peut s’intégrer dans le chromosome d’une bactérie F+, appelés épisomes, donc leur réplication est sous le contrôle du chromosome. Bactérie Hfr Bactérie Hfr (Haute fréquence de recombinaison) En effet, les séquences IS du plasmide F ont des séquences homologues sur le chromosome. L’insertion se fait par recombinaison site spécifique. IS Bactérie F+ Dans ce cas le plasmide peut mobiliser le transfert de l’ADN chromosomique d’une cellule vers une autre et être incorporé dans le chromosome par recombinaison entre les régions homologues. Conjugaison entre bactérie Hfr et bactérie uploads/Sante/ biologie-moleculaire-microbienne.pdf