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Materiels et methodes partie 2

IV Conservation des champignons Les isolats fongiques purs sont conservés pour une courte durée ou une longue durée IV Identi ?cation moléculaire des isolats sélectionnés Six isolats fongiques ont été sélectionnés pour l ? analyse moléculaire IV Extraction d ? ADN fongique L'ADN a été extrait des mycéliums fongiques par l ? utilisation du kit Qiagen Dneasy mini Plant en suivant le protocole du fabriquant QIAGEN Hilden Germany IV Ampli ?cation d ? ADN Les régions ITS internally transcribed spacer de l ? ADNr nucléaire ont été ampli ?ées par PCR à l ? aide du couple d ? amorces spéci ?que des champignons ITS ITS ITS ? - TCCGTAGGTGAACCTGCGC- ? ITS ? -TCCTCCGCTTATTGATATGC- ? Les cycles de réactions de PCR se composent de phases principales la dénaturation de l ? ADN l ? hybridation et l ? élongation Les cycles sont programmés dans le thermocycleur Les produits d ? ampli ?cation ont été révélés après une électrophorèse Après migration l ? ADN a été visualisé et photographié sous UV IV Séquençage Le séquençage automatisé du fragment ITS de l ? ADN ribosomale est réalisé selon la technique de Sanger GATC biotech Germany IV Analyse phylogénétique Les séquences ont été alignées en utilisant le software disponible MUSCLE L'histoire évolutive a été déduite en utilisant la méthode de Maximum Likelihood et Tamura parameter model IV Tests préliminaire pour la biodégradation des hydrocarbures pétroliers IV Test de l ? indicateur redox -dichlorophénol indophénol DCPIP La capacité des champignons isolés à dégrader le pétrole le diesel et l ? huile de moteur usagée a été initialement examinée selon la technique modi ?ée de Hanson et al basé sur l'indicateur redox dichlorophénol indophénol DCPIP Le milieu minéral Bushnell-Haas BH a été utilisé pour le test de sélection qui consiste en MgSO g l CaCl g l KH PO g l K HPO g l NH NO g l et FeCl g l eau distillée ml pH CFigure Test de dégradation des hydrocarbures par l ? indicateur redox DCPIP IV Test de dégradation utilisant un milieu spéci ?que Les isolats fongiques sont transférés dans un milieu spéci ?que pour la croissance des champignons adaptés aux hydrocarbures hydrocarbon-adapted fungi HAF ? selon Oudot et al Le milieu est composé de KC g l NaH PO g l MgSO g l NO NH g l eau distillée ml Chaque isolat est cultivé dans des tubes x mm qui contiennent ml du milieu HAF et ml de pétrole diesel ou l ? huile usagée Figure Protocole de dégradation des hydrocarbures en milieu HAF Les isolats fongiques qui montrent une croissance visible de mycélium ou d'hyphes et ou une sporulation sont évalués comme potentiellement capables d'utiliser les hydrocarbures pétroliers comme source de carbone et d'énergie IV Etude quantitative de la biodégradation des hydrocarbures IV Test de biodégradation des hydrocarbures en milieu liquide La mesure du pourcentage de dégradation de chacun des trois huiles pétrolières a été réalisée en milieu BH liquide L ? expérimentation est faite dans des acons