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DÉNOMBREMENT ET IDENTIFICATION DES BACTÉRIES 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-2 10-1 10-4

DÉNOMBREMENT ET IDENTIFICATION DES BACTÉRIES 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-2 10-1 10-4 10-3 10-5 PCA PCA PCA PCA PCA PCA PCA PCA PCA PCA PCA PCA EXEMPLES: Dilution Nombre de colonies par boite de Pétri 10-2 Plus de 300 10-3 150; 183; 120 10-4 45; 70; 35 10-5 2; 1; 3 = + ∑ d n n V C ) 1 , 0 ( 2 1 = + + + + + + ) 3 . 1 , 0 3 ( 1 35 70 45 120 183 150 10-3 183. 103 = 18. 104 UFC/ml d n n V C ) 1 , 0 ( 2 1 + ∑ C : Nombre de colonies sur les boites de chaque dilution retenue V : Volume de la suspension bactérienne déposée sur la boite (ml) n1: nombre de boites correspondant à la plus faible dilution n2 : nombre de boites correspondant à la plus forte dilution d: dilution correspondant à la boite de la plus faible dilution DÉNOMBREMENT SUR LAME DÉNOMBREMENT SUR MILIEU LIQUIDE TECHNIQUE COLORIMÉTRIQUE (NPP) 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-2 10-4 10-3 10-5 + + + + + - + - - - - - 3 1 0 2 3 3 3 2 2 2 0 1 2 9 15 21 N =15. 102 Tableau de Mac Grady TECHNIQUE DE FILTRATION SYSTÈME DE FILTRATION TECHNIQUE DE FILTRATION MEMBRANE DE FILTRATION SOUS MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE COLONIES MICROBIENNE SUR LES MEMBRANES DE FILTRATION DÉNOMBREMENT DES COLIFORMES ET DES ENTEROCOQUES PAR FILTRATION TECHNIQUES D’ISOLEMENT SCHÉMA GÉNÉRALE D’ISOLEMENT TECHNIQUE D’ISOLEMENT PAR DILUTION ENSEMENCEMENT TECHNIQUE D’ISOLEMENT PAR ÉPUISEMENT (TECHNIQUE DES QUADRANT) ISOLEMENT SUR MILIEUX SÉLECTIFS Staphylococcus aureus ISOLEMENT SUR MILIEUX SÉLECTIFS ISOLEMENT SUR MILIEUX SÉLECTIFS ISOLEMENT SUR MILIEUX SÉLECTIFS IDENTIFICATION BACTÉRIENNE I. L’IDENTIFICATION PHÉNOTYPIQUE Les méthodes d’identification choisies doivent être rapides et informatives afin d’assurer une identification la plus rapide possible. La démarche diagnostique se fait globalement en 2 étapes : - Test d’orientation - Identification d’espèce 1- Les tests d’orientation (Famille ou genre): - Caractères Structuraux (Gram, bacille, coque, spirille, incurvé, ramifié, mode de groupement …), - Caractères Culturaux (aspect des colonies, type d’hémolyse…), - Caractères Métaboliques (oxydase, catalase, coagulase), -Tests unitaires : - Présence d’une coagulase : S. aureus - Colonies violettes avec éclat métalliques sur milieu EMB: E. coli 2- Identification d’espèce: Elle est généralement basée sur la fermentation des sucres est la mise en évidence de certaines enzymes essentielles (ADNase, LCD…) caractéristique de chaque espèce bactérienne. N.B: le poids du caractère dépend du groupe bactérien à identifier. EXEMPLE D’IDENTIFICATION Gram + Mobilité - Catalase - Croissance en anaérobiose + Production de gaz - Production d’indole - Nitrate réductase - Gélatinase - Coagulation du lait écrémé + Fermentation des sucres Sorbose - Dulcitol - Glycérol - Rahmnose - Inositol - Adonitol - Tableau1 : Caractère du genre de Bifidobacterium. Sorbitol - - L-arabinose + - D-xylose + - Salicine - + Cellobiose - - D-raffinose + + Manitol - - D-mannose + V Galactose + + Maltose + + Amidon - - Conclusion B. longum B. infantis Tableau 2 : Caractères métaboliques des espèces de Bifidobactéries. LES TECHNIQUES D’IDENTIFICATION AUTOMATISÉES MÉTHODES AUTOMATISÉES: LES MICROPLAQUES MÉTHODES AUTOMATISÉES – GALERIES D’IDENTIFICATION LIMITES DES TECHNIQUES PHENOTYPIQUE Les techniques phénotypiques ne sont pas adaptées au diagnostic des bactéries dont la culture est lente ou difficile (Chlamydiae, Rickettsiae…) ou aux germes non cultivables puisque la condition initiale est de disposer d’une culture pure de l’espèce à identifier. D’autres limites proviennent des tests en eux-mêmes et leur nombre limité. Elles ne représentent qu’une faible partie du phénotype des bactéries; même en multipliant le nombre de caractères étudiés (jusqu’à 300 parfois), la taxonomie numérique n’évalue que 5 à 20% du potentiel génétique d’une bactérie. Certains facteurs (climat, géographie), peuvent intervenir et être responsables de grandes modifications dans l’identification. Les origines (cliniques, vétérinaires, environnementales, agro-alimentaires et géographiques) conditionnent dans une certaine mesure le choix des propriétés biochimiques testées. Attention une souche représentative d’une espèce rencontrée aux USA peut avoir des propriétés biochimiques ou une distance génétique différente par rapport à d’autres souches, de la même espèce, isolées en Europe. Les tests peuvent aussi être erronés par :  La variation du phénotype par la présence ou l’absence d’un plasmide codant pour des fonctions métaboliques.  La variation de la taille de l’inoculum et la durée d’incubation  Des profils différents entre des souches récemment isolées et celles qui sont qui sont conservées depuis longtemps.  Critères différents pour les bactéries d’un environnement différent (bactéries à intérêt biomédical par rapport aux bactéries de l’environnement par exemple)  Expression différente des caractères phénotypiques selon la température, la  composition du milieu de culture.  Systèmes spécifiques à des taxons particuliers (par exemple les entérobactéries) et qui ne peuvent s’appliquer aux autres bactéries. II. L’IDENTIFICATION GÉNOTYPIQUE TECHNIQUE DE SÉQUENÇAGE DE L’ADN RIBOSOMAL (Micro seq) TECHNIQUE DES PUCES À ADN  Deux applications importantes des puces à ADN dans l’analyse microbiologique:  Analyse d’une population bactérienne mixte.  Détection de régions chromosomiques spécifiques d’un isolat. HYBRIDATION ADN/ADN Détermination de ΔT LES INDICATEURS DE CONTAMINATION FÉCALES  Pourquoi rechercher des indicateurs et ce n’ai pas les pathogènes? C’est quoi un indicateurs de contamination fécales? Quels sont ces indicateurs? - les coliformes (E.coli). - les entérocoques (Streptocoques fécaux) - les Clostridium sulfitoréducteurs (C. perfringens). Comment les rechercher et/ou dénombrés? 1) Les coliformes totaux et fécaux. 2) les entérocoques totaux et fécaux (Streptocoques fécaux) 3) les Clostridium sulfitoréducteurs (C. perfringens). Tests supplémentaires: - Salmonella-shigella (demande motivée) - Staphylococcus aureus. - Pseudomonas aeruginosa N.B Les tests supplémentaires sont diffèrent selon le produit analysé. 1) LES COLIFORMES TOTAUX ET FÉCAUX.  préparation d’une solution mère: 25g (ml) dans 225 ml d’eau physiologique stérile).  Dénombrement des coliformes totaux sur BCPL ou BLBVB par la technique NPP.  Confirmation de la présence des coliformes fécaux: recherche d’E. coli. 2) LES ENTÉROCOQUES (STREPTOCOQUES FÉCAUX)  Dénombrement des entérocoques totaux sur milieu de Rothe.  Confirmation de la présence des entérocoques fécaux (Streptocoques fécaux) sur milieu EVA Litsky. 3) LES CLOSTRIDIUM SULFITORÉDUCTEURS (C. PERFRINGENS).  Recherche et dénombrement des Clostridium sulfitoréducteurs sur gélose viande foie additionné de l’alun de fer et du sulfite de sodium. TESTS SUPPLÉMENTAIRES: Les salmonelles. - Enrichissement sur milieu sur bouillon au sélénite. - isolement sur milieu S-S. COLORIMÉTRIE (Fermentation + Production de Gaz) Résultats Sur Milieu Kligler (Aussi Sur TSI ou KIA) Résultats Sur Milieu Kligler (Aussi Sur TSI ou KIA) Résultats Sur Milieu Kligler (Aussi Sur TSI ou KIA) PRODUCTION D’INDOLE TEST DU CITRATE DE SODIUM TEST DE VP (Vogues Proskauer) TEST DE RM (Rouge de Méthyl) TEST DE L’URÉASE TEST DE MOBILITÉ TEST DE MANNITOL MOBILITÉ TEST DE LA NITRATE RÉDUCTASE TEST D’OXYDASE TEST DE DNase sur milieu fluorescent TEST DE LA COAGULASE Milieu Chapman TEST DE CATALASE TEST DE CATALASE uploads/s1/ denombrement-et-identification.pdf