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29/08/2020 Université de Tlemcen Faculté des SNV/STU Département de Biologie LA

29/08/2020 Université de Tlemcen Faculté des SNV/STU Département de Biologie LARABI DOUNIA RACHA Tp :01 : Examen microbiologie des prélèvements cliniques Principe : utilisation d’un jeu de colorants / décolorants agissant chimiquement sur les éléments de la paroi bactérienne qui, en fin de réaction prennent une teinte caractéristique en onction de sa compostion. Objectifs : * reveler la forme (morphologie) de la bactérie (coque, bacille, coccobacille = forme intermediaire entre bacille et coque , spirale…) *visualiser le mode de rassemblement des bactéries *visualiser la couleur (teinte) de la bactérie et donc de prédire sa structure de paroi Matériel : Les colorants : Violet de gentiane ou cristal violet (bleu violacé) qui colore le peptidoglycane Lugol (iodo-iodure de potassium) de couleur brun foncé il s’agit d’un colorant mordant permettant de fixer le cristal violet sur les structures bactérinnes La fuschine : colorant rouge qui permet de recolorer les structures bactériennes des Gram négatif qui seront décolorés par l’alcool2) Le décolorant : L’alcool éthylique a 96°De gauche a droite :Lugol -Alcool -Violet de gentiane ou cristal violet -fuschine Procedure (Cf TP de bactériologie): 1)Confection des frottis  Déposer une goutte d'H20 sur la lame.  Toucher une colonie à l'aide d'une pointe jaune ou d'un cure-dent stérile pour prélever des bactéries. Il n'est pas nécessaire de prendre beaucoup de bactéries  Frotter la pointe dans la goutte d'eau.  Passer 3 fois la lame dans la petite flamme (veilleuse) du bec Bunsen pour fixer l'échantillon à la chaleur. Etapes de préparation d’une frottis 2) Coloration et explications: (attention aux éclaboussures, mettez des gants) 1) Coloration au violet de gentiane (1 minute) 2) Mordansage par le lugol (30 sec) 3) Décoloration a l’alcool (5 a 10 sec) 4) contre-coloration a la fuschine (1 minute) Technique et principe de Coloration de Gram Explication ;  Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.  Le Lugol (composé iodé) est un mordant qui permet de fixer le violet dans les bactéries.  La solution de décoloration contient un mélange d'alcool et d'acétone. Les pores de la paroi des Gram+ sont fermés par la déhydratation à l'alcool. La paroi est alors imperméable et le colorant violet reste dans les bactéries. La membrane des Gram- est dissoute par le mélange alcool- acétone. La paroi plus mince et de composition différente laisse alors sortir la coloration violette.  la solution de safranine (rose) . Ce colorant permet de visualiser les bactéries Gram- décolorées à l'étape précédente. Cette coloration moins forte que le violet n'affecte pas la couleur des Gram+ Observation Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au grossissement 1000x ). Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au grossissement 1000x ). Résultat : j’ai observédes Cocci a Gram + en amas (Staphylococcus aureus) Figure ; image microscopique d’une bactérie (Staphylococcus aureus) Gram+ Et des Bacilles ,(E.coli) a gram négatif , disposés de façon isolés Figure ; image microscopique d’une bactérie Bacilles ,(E.coli) a gram négatif Conclusion Le colorant utilisé est le violet de gentiane qui colore l'intérieur des bactéries. Celles-ci sont ensuite décolorées à l’alcool-acétone. En raison de leur paroi de structure plus épaisse et de composition chimique particulière, les bactéries Gram+ gardent la coloration violette. Les bactéries Gram-, avec une paroi plus fine et plus perméable à la décoloration, perdent la couleur violette. De manière à visualiser les bactéries Gram-, on recolore avec de la fuschine (rose). Les bactéries Gram+ resteront violettes alors que les Gram- seront maintenant teintées en rose. Bien que le résultat de la coloration de Gram peut dépendre de l’état physiologique des bactéries (âge de la colonie, conditions de croissances...) elle reste cependant la technique de coloration de base de la bactériologie uploads/s3/ tp-1 2 .pdf