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Détection de la résistance à l’oxacilline chez Staphylococcus aureus : comparai

Détection de la résistance à l’oxacilline chez Staphylococcus aureus : comparaison de cinq techniques utilisables en routine Comparison of ﬁve usual techniques for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus T. Gueudet *, C. Lemblé Laboratoire bactériologie-C. Lemblé, centre hospitalier de Sélestat, 23, avenue Pasteur, BP 216, 67604 Sélestat, France Reçu le 29 juin 2004 ; accepté le 14 septembre 2004 Disponible sur internet le 27 octobre 2004 Résumé La détection de la méthicillinorésistance de Staphylococcus aureus est un test pratiqué quasi quotidiennement au laboratoire de microbiologie. Son interprétation n’en est pas pour autant simple à chaque fois car l’expression phénotypique de cette résistance est très variable in vitro. Les auteurs étudient cent isolats cliniques de S. aureus. La détection de la méthicillinorésistance s’effectue par cinq techniques différentes, la technique de référence étant le Latex MRSA bioMérieux®. Les résultats sont les suivants : • diffusion en milieu gélosé Mueller Hinton NaCl 5 % ﬂacon 100 ml BIORAD®, disque d’oxacilline 5 µg, inoculum 0,5 McF et incubation 37 °C 24 heures : spéciﬁcité 91 % ; • diffusion en milieu gélosé Mueller Hinton NaCl 5 % précoulé AES®, disque d’oxacilline 5 µg, inoculum 0,5 McF et incubation 37 °C 24 heures : spéciﬁcité 95 % ; • milieu Oxascreen Agar BD® NaCl 2 % Oxacilline 6 µg inoculum 10 µg/0,5 McF et incubation 37 °C 24 heures : spéciﬁcité 96 % ; • cupule oxacilline en milieu Mueller Hinton NaCl 2 % galerie ATB Staph bioMérieux®, inoculum 2,0 McF et incubation 37 °C 24 heures : spéciﬁcité 100 % ; • diffusion en milieu gélosé Mueller Hinton précoulé bioMérieux®, disque de cefoxitine 30 µg, inoculum 0,5 McF et incubation 37 °C 24 heures : spéciﬁcité 100 %. Les résultats obtenus nous ont permis de dégager l’intérêt de la cefoxitine en complément des techniques usuelles dans la détection de la méthicillinorésistance de S. aureus. © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract The detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an usual and daily test in a microbiology laboratory. But its interpretation isn’t easy because the resistance expression in vitro is so variable. The authors compare ﬁve methods about 100 clinical isolated strains. The results are: • disk diffusion method using oxacillin 5 µg, on a NaCl 5% Mueller Hinton agar, 100 ml presentation (biorad®): speciﬁcity 91%; • disk diffusion method using oxacillin 5 µg, on a NaCl 5% Mueller Hinton agar, ready to use plate (AES®): speciﬁcity 95%; • the Oxascreen agar (BD®): speciﬁcity 96%; • the oxacillin cupule of ATB STAPH strip (ATB expression bioMerieux® system) NaCl 2% semi solid Mueller Hinton agar medium: speciﬁcity 100%; • disk diffusion method using cefoxitin 30 µg, on a Mueller Hinton agar plate (bioMerieux®): speciﬁcity 100%. * Auteur correspondant. Adresse e-mail : t-gueudet@biosphere.fr (T. Gueudet). Pathologie Biologie 52 (2004) 617–621 http://france.elsevier.com/direct/PATBIO/ 0369-8114/$ - see front matter © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2004.09.005 Therefore the cefoxitin disk diffusion method is very interesting to make better the difference between methicillin-resistant and methicillin- sensible S. aureus, in association with the ATB STAPH® strip. © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Méthicillinorésistance ; Staphylococcus aureus ; Techniques de détection ; Cefoxitine ; Routine Keywords: Methicillin-resistant; Staphylococcus aureus; Usual methods of detection; Cefoxtin 1. Introduction [1,2] L’origine de la méthicillinorésistance chez Staphylococ- cus aureus est triple : • chromosomique : c’est la principale. Elle est le fait de la présence d’un gène mecA qui contrôle la synthèse de PLP additionnelles « anormales » ayant une très faible afﬁnité pour toutes les bêtalactamines. De très fortes variations d’expression de la méthicillinorésistance sont observées d’une souche à l’autre et selon les conditions de culture. On parle d’expression hétérogène de la résistance. Qua- tre classes ont été décrites par Tomasz en fonction de la proportion de mutants résistants au sein de la souche étudiée ; • enzymatique : l’hyperproduction de bétalactamase aboutit à un bas niveau de résistance à l’oxacilline. Ces souches sont baptisées BORSA (Borderline Oxacilline Resistant Staphylococcus aureus). Cette résistance est restaurée in vitro par les inhibiteurs de bêtalactamases ; • par modiﬁcation des PLP : les PLP sont normales. Elles ne sont pas néosynthétisées mais leur afﬁnité pour les bêtalactamines est diminuée, modiﬁée (souche MODSA pour Modiﬁed Staphylococcus aureus). Ces souches sont rares. Face à cette variabilité et cette hétérogénéité, on com- prend qu’il n’est pas toujours aisé de détecter la méthicilli- norésistance. Le biologiste doit choisir une technique repro- ductible, facile à mettre en œuvre et surtout assez sensible pour détecter les bas niveaux de résistance. Ce choix se fera parmi les techniques phénotypiques qui restent prépondérantes en routine bien que la précision et la sensibilité des techniques génotypiques en fassent bien en- tendu la référence. Nous avons comparé cinq d’entre elles pour retenir celle qui nous semblerait la plus ﬁable sans négliger l’aspect de la praticabilité, de la rapidité et du coût. 2. Matériel et méthodes 2.1. Les souches L’étude porte sur 100 souches de S. aureus isolées à l’hôpital de Sélestat de juin 2001 à février 2002. Aucune restriction de service, ni d’origine de prélèvement n’inter- vient ; seuls les doublons sont exclus. La plupart des prélè- vements est à visée diagnostique. Le contrôle de qualité est assuré par les souches de réfé- rence de S. aureus ATCC 29213, CIP 106414 et CIP 106415. 2.2. Les techniques d’étude de la méthicillinorésistance Cinq techniques sont sélectionnées en fonction des re- commandations ofﬁcielles en 2002 [3], des offres du marché, de l’automatisation du laboratoire d’étude et des nouvelles connaissances scientiﬁques [4,5] : • diffusion, sur milieu gélosé Mueller Hinton (MH) NaCl 5 % coulé au laboratoire à partir de ﬂacons 100 ml, d’un disque d’oxacilline 5 µg, inoculum 0,5 McF et incubation à 37 °C pendant 24 heures ; • diffusion, sur milieu gélosé MH NaCl 5 % précoulé, d’un disque d’oxacilline 5 µg, inoculum 0,5 McF et incubation à 37 °C pendant 24 heures. Remarque : Ces deux techniques correspondent aux an- ciennes recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM) qui ont évolué dans le temps vers une concentration plus faible en NaCl mais au jour de la réalisation de cette étude la gélose MH NaCl 2 % n’était pas disponible sur le marché ; • pousse sur une gélose MH NaCl 2 % additionnée d’oxa- cilline à la concentration de 6 µg /ml, inoculum 0,5 McF et incubation à 37 °C pendant 24 heures ; • pousse dans la cupule oxacilline en milieu semi-liquide (MH NaCl 2 %) d’une galerie API, inoculum 2,0 McF et incubation à 37 °C pendant 24 heures ; • diffusion sur milieu gélosé MH précoulé d’un disque de cefoxitine 30 µg, inoculum 0,5 McF et incubation à 37 °C pendant 24 heures. La technique de référence choisie est la recherche de la PLP2a par un test d’agglutination de particules de latex sensibilisées par un anticorps monoclonal [6]. Elle est réali- sée avec une suspension dense en différentes colonies. 2.3. Le protocole 2.3.1. Matériel Disques d’oxacilline 5 µg et de cefoxitine 30 µg et Aug- mentin® (Oxoid®), Gélose MH hypersalée NaCl 5 % ﬂacon de 100 ml (Biorad®), Gélose MH hypersalée NaCl 5 % lot de 20 boites (AES®), Gélose MH lot de 20 boites (bioMé- rieux®), Oxascreen agar (BD®), Galerie API ATB STAPH (bioMérieux®), Latex MRSA (bioMérieux®). 2.3.2. Technique À partir des cultures de 18 à 24 heures sur gélose au sang, on réalise une suspension à 0,5 McF. 10 µl de cette suspen- 618 T. Gueudet, C. Lemblé / Pathologie Biologie 52 (2004) 617–621 sion sont déposés sur la gélose Oxascreen®. Le reste de la suspension est dilué au 1/100 pour ensemencer par inonda- tion une gélose MH, deux géloses MH hypersalées (l’une coulée au laboratoire et l’autre précoulée). Après séchage d’une heure, un disque d’oxacilline est déposé sur chacune des trois boites, et un disque de cefoxitine et d’Augmentin® sont déposés sur la gélose non hypersalée. Ce dispositif permettra de repérer les souches présentant une bétalacta- mase, y compris BORSA (image de restauration de l’activité des bêtalactamines). La galerie API ATB STAPH® et le latex MRSA® sont réalisés suivant les recommandations du fabri- cant. La lecture s’effectue au bout de 24 heures d’incubation à 37 °C (mesure du diamètre sur les géloses avec disque, recherche d’une pousse sur la gélose Oxascreen®) et dans la cupule de la galerie API ATB Staph® (lecture sur automate ATB expression bioMérieux®). Les diamètres critiques retenus sont 20 mm pour l’oxacil- line (≥20 mm sensible ; < 20 mm résistant) et de 22 mm pour la cefoxitine (≥22 mm sensible ; < 22 mm résistant). Les souches sont passées en série et à chaque nouvelle série, une souche de référence est incluse permettant sa validation. 3. Résultats et discussion 3.1. Résultats globaux et comparaison de la spéciﬁcité (Tableau 1) Au ﬁnal et en étudiant chaque souche individuellement (antibiotype et Latex MRSA® compris) on obtient 51 sou- ches méthicillinosensibles et 49 souches méthicillinorésis- tantes. Les 49 souches méthicillinorésistantes ont été clas- sées comme telles et sans problème uploads/s3/ gueudet2004-pdf.pdf