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Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie INRA TOULOUSE La PCR en temps réel. Ch

Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie INRA TOULOUSE La PCR en temps réel. Choix d’amorces et analyse des résultats UR66, janvier 07 Pascal MARTIN : Pascal.Martin@toulouse.inra.fr Plan ¾La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes ¾Principes de base ¾Le choix des amorces de PCR ¾La mise au point d’un dosage en SYBR Green ¾Les choix méthodologiques pour l’analyse des résultats UR66, janvier 07 UR66, janvier 07 La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes Mesurer l’«expression d’un gène» = mesurer l’abondance des transcrits produits par ce gène à un instant donné Abondance relative (unités arbitraires) ou abondance absolue (nombre de copies ou µg/µL) En pratique, la quantification relative est la plus utilisée en raison de la difficulté qu’il y a à construire une courbe de calibration absolue (l’utilisation de plasmides ou de produits de PCR est dangereuse…). UR66, janvier 07 La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes Etapes initiales : Organe Cellules Traités vs non traités Sauvage vs transgénique ARN total ADNc Extraction ARN Transcription inverse Dosage Dosage au spectrophotomètre (A260nm) : pas d’évaluation d’une potentielle dégradation différentielle des ARNs Transcription inverse : pas d’évaluation des différences potentielles d’efficacité de transcription inverse IL EST NECESSAIRE DE CALIBRER NOS DONNEES PAR RAPPORT A UNE QUANTITE QUI EST CONSTANTE ENTRE LES DIFFERENTS ECHANTILLONS D’ARN INTACT. Contrôle endogène = gène de ménage = housekeeping gene UR66, janvier 07 La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes Je calibre Je ne calibre pas 2 boîtes de cellules identiques (A et B). ARNA non dégradé, ARNB dégradé à 50%. RTA et RTB efficaces à 100%. (gène X)A=20, (gène X)B=10. (β-actin)A=200, (β-actin)B=100 (gène X)A / (β-actin)A = 0.1 (gène X)B / (β-actin)B = 0.1 (gène X)A = 20 (gène X)B = 10 Idem mais cette fois-ci efficacité RTB=50% => (gène X)B=5 et (β- actin)B=50 Je calibre Je ne calibre pas (gène X)A / (β-actin)A = 0.1 (gène X)B / (β-actin)B = 0.1 (gène X)A = 20 (gène X)B = 5 Cycle number Fluo ~ DNA quantity Exponential phase Linear phase Plateau phase Not detected UR66, janvier 07 Principes de base Cycle number Exponential phase Linear phase Fluo ~ DNA quantity Principes de base UR66, janvier 07 UR66, janvier 07 Principes de base Ct threshold ΔRn = ROX normalized signal – ROX normalized baseline signal Nombre de cycles Baseline ΔRn Nombre de cycles Distance = 1 cycle Dilutions au 1/10ème => 3.32 cycles de distance UR66, janvier 07 Principes de base UR66, janvier 07 Principes de base 1) l’accumulation de la fluorescence est proportionnelle à l’accumulation du produit de PCR qui nous intéresse => notion de spécificité, choix des primers 2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents échantillons 3) Le seuil utilisé dans les analyses doit être fixé de manière à couper toutes les courbes de PCR au niveau de la phase exponentielle afin d’être sûr que le CT est bien représentatif du nombre initial de copies de l’ARN et pas de différences de cinétique entre les PCRs Peirson SN et al., NAR, 2003 UR66, janvier 07 Principes de base 1) l’accumulation de la fluorescence est proportionnelle à l’accumulation du produit de PCR qui nous intéresse => notion de spécificité, choix des primers En SYBR Green, si mes amorces font des dimères, si j’amplifie un ou des produits de PCR non spécifiques ou bien si j’amplifie de l’ADN génomique, je ne sais plus ce que représente concrètement l’intensité de fluorescence en ordonnée (mon produit de PCR? Des dimères de primers? Un autre amplicon? Un peu de tout ça?) C’est un choix judicieux des amorces de PCR qui va me permettre d’assurer la spécificité nécessaire Remarque : en TaqMan, c’est un choix judicieux de ma sonde TaqMan qui va assurer la spécificité de quantification UR66, janvier 07 Principes de base 2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents échantillons 0,0E+00 2,0E+09 4,0E+09 6,0E+09 8,0E+09 1,0E+10 1,2E+10 0 5 10 15 20 25 30 35 E=2, X0=10 E=2, X0=20 E=1.95, X0=10 25 30 UR66, janvier 07 Principes de base 2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents échantillons Avec 95% d’efficacité de PCR, au bout de 26-27 cycles, on obtient deux fois moins de produit de PCR qu’avec une efficacité de 100% On doit donc vérifier que l’on a bien la même efficacité de PCR entre les différents échantillons et essayer d’identifier si certains échantillons ont une efficacité de PCR différente des autres. UR66, janvier 07 Principes de base 3) Le seuil utilisé dans les analyses doit être fixé de manière à couper toutes les courbes de PCR au niveau de la phase exponentielle afin d’être sûr que le CT est bien représentatif du nombre initial de copies de l’ARN et pas de différences de cinétique entre les PCRs High precision during exponential phase Variable plateau phase 96 Replicates PCR Product Applied Biosystems – David Favy UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR Primer Express 2.0 UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR Spécificité On ne veut amplifier que notre ADNc d’intérêt et pas un autre ADNc. Cet aspect est fondamental, en particulier si on s’intéresse à une famille multigénique ou à un transcrit alternatif précis Même si notre échantillon d’ADNc est un peu contaminé par de l’ADN génomique, on aimerait que l’amplification de ce dernier ne soit pas possible On ne veut pas que nos amorces puissent s’auto-amplifier en formant des dimères d’amorces 1 2 3 Outils 1 2 3 Connaissance de la séquence et des séquences qui présentent des homologies. Connaissance du ou des transcrits étudiés. GenBank, BLAST, Ensembl, PubMed, Multalin, Entrez… Choix des primers sur deux exons différents séparés par un intron d’au moins 1-2 Kb. Ensembl, Entrez, BLAST Etude des primers sous Primer Express (Primer Test Document) UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide Un choix judicieux d’amorces ne peut se faire sans une solide connaissance de votre séquence de départ, … 1 UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR …des homologies que présente cette séquence avec d’autres transcrits, … 1 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/ + ClustalW +ClustalX +etc… UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR …de l’existence de transcrits alternatifs ou de gènes codés sur le brin complémentaire 1 www.ensembl.org/index.html UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR ADN génomique et ADN complémentaire 2 ADN génomique ADNc ADN génomique ADNc Cas où l’on a que des introns de petite taille : 3-4 bases maxi, sinon … UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR 3 Absence de dimères de primers 5’ 3’ Loop-back 3’-3’ dimer 3’ 3’ 5’-5’ dimer 5’ 5’ Pas d’extension possible donc pas un problème Toujours penser à réaliser toutes les combinaisons possibles : sens/sens, antisens/antisens et sens/antisens UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR 3 Absence de dimères de primers OK OK OK, mais … UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR 3 Absence de dimères de primers OK NON NON UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR 9Pas plus de G que de C (essayer le réverse complément…) 9<4 G contigus 9Maximum de 2/5 G ou C en 3’ (specificité) 9Pas de G à l’extrémité 5’ (quenching) 9<2°C différence de Tm entre les 2 amorces 9Longueur 9-40 bases 9Longueur 9-40 bases 920-80% GC 920-80% GC 950-150 bp de longueur (efficacité de PCR) 9Tm 10°C de plus que le Tm des amorces (7°C pour discrimination allélique) 9Tm 58-60°C Amplicon Sonde TaqMan Amorces Les critères pris en compte par Primer Express ********* ********* ********* ********* ********* UR66, janvier 07 Le choix des amorces de PCR Autres critères ¾ Classement des amorces selon le critère de pénalité. Ce critère n’est pas comparable d’une recherche d’amorces à l’autre. ¾ Présence de polymorphismes? Critique surtout pour les polymorphismes situés en 3’. Voir les bases de données ¾ Parfois, il faut fixer « à la main » l’une des deux amorces. Dans ce cas, il est critique de s’assurer que son Tm est bien compris entre 58 et 60° et qu’elle ne risque pas de former de dimères d’amorces. ¾ … j’en oublie certainement… mais dans la plupart des cas, rien ne vaut les tests en tubes… UR66, janvier 07 Mise au point d’un dosage en SYBR Green 1) Etude de la séquence du gène à étudier 2) Choix des amorces de PCR 3) Optimisation des concentrations d’amorces et vérification de la spécificité 4) Réalisation d’une courbe standard 5) Dosage des échantillons d’intérêt UR66, janvier 07 Mise au point d’un dosage en SYBR Green 3) Optimisation des concentrations d’amorces et vérification de la spécificité 900/900 900/300 900/50 900 300/900 300/300 300/50 300 50/900 50/300 50/50 50 900 300 50 Reverse Primer (nM) Forward Primer (nM) Le Tm d’une amorce dépend de sa concentration [50;900nM] ~ Tm + [0;4°C] UR66, janvier 07 Mise au point d’un dosage en SYBR Green 3) Optimisation des concentrations d’amorces et vérification de la spécificité Faible reproductibilité, CT tardifs 300/300 uploads/s3/la-pcr-en-temps-reel-ppt.pdf