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Cr 8 cytoge ne tique mole culaire

Cytogénétique Moléculaire Pr Ahmed Bouhouche CIntroduction CIntroduction Le caryotype est l'examen génétique le plus prescrit car il permet une analyse globale du génome Il permet de détecter des anomalies Mais il possède un faible niveau de résolution - caryotype classique bandes - Mb bande Il met en évidence des anomalies de nombre et de structure de taille su ?sante Limites - impossibilité de caractériser ?nement un remaniement visible résolution - les remaniements cryptiques ne sont pas visibles - impossible à réaliser en l'absence de mitose La cytogénétique moléculaire permet d'augmenter ce niveau de résolution CIntroduction Caryotype Examen de ère intention Limites de la cytogénétique conventionnelle - obtention de métaphases - résolution ?? Mb Intérêt de la Cytogénétique Moléculaire ? CLa Cytogénétique Moléculaire Cytogénétique conventionnelle Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire CLes di ?érentes techniques v FISH Hybridation In Situ en Fluorescence ? Principe ? Avantages et inconvénients v CGH Hybridation Génomique Comparative ? Principe ? Sensibilité v FISH et CGH Limites des techniques v Puces à ADN ? Dé ?nitions ? Di ?érents types de puces ? CGH-array ? Puces à SNP ? Intérêts applications inconvénients CFISH et CGH CFISH Principe ? Hybridation in situ uorescente FISH ? Fragments d ? ADN marqués par un uorochrome Sonde Fixation de la sonde par complémentarité Les sondes sont marquées soit avec une molécule uorescente soit avec un haptène molécule qui peut être reconnue par un anticorps Au microscope on repère la présence ou l ? absence de la sonde utilisée et le nombre d ? exemplaire Cette sonde est mise en contact avec les chromosomes d'une mitose ou de noyaux interphasiques et va s'hybrider se ?xer spéci ?quement au niveau de sa séquence complémentaire On peut alors visualiser la sonde au microscope dont l'emplacement identi ?e précisément la région chromosomique dont elle est complémentaire ? Cette technique peut être appliquée sur des métaphases ou directement sur des noyaux en interphase CFISH La procédure -Le principe de la technique d ? hybridation in situ en uorescence avec des sondes froides FISH est basé sur le fait que l ? ADN est une molécule double hélice formée de deux brins complémentaires -Ces deux brins peuvent être séparés par la chaleur et ou par un traitement acide ou alcalin I ETAPE DE DENATURATION -Une sonde d ? acide nucléique contenant une séquence complémentaire au simple brin d ? ADN peut alors former un hybride spéci ?que avec l ? ADN simple brin II ETAPE D ? HYBRIDATION -Cette sonde est marquée directement ou indirectement avec un ou plusieurs uorochromes l ? hybridation des séquences nucléiques complémentaires peut être visualisée en uorescence après contre coloration du support chromosomes ou noyaux III ETAPE DE REVELATION CFISH La procédure SONDE CIBLE ADN double brin marqué ATT CCT AT Dénaturation thermique TAA GGAT A ADN double brin mitoses ou noyaux interphasiques Hybridation complémentaire C O N CFISH La procédure Elimination des sondes non spéci ?quement ?xées La sonde moléculaire se ?xe sur sa cible Lavages Pas de sonde ?xée délétion Analyse