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Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Départe

Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique) Mr Hireche A 1 Chapitre 5 : les enzymes immobilisés : 1. Introduction : Dans la nature, les enzymes sont fortement liés à des supports tels que les membranes cellulaires ou d’autres supports biologiques. Cette fixation permet la préservation des enzymes dans les cellules conduisant à la possibilité de leurs réutilisations par l’organisme sans le besoin de synthèse de l’enzyme à chaque fois que la cellule doit l’utilisé. Dans la pratique, les applications industrielles des enzymes en solution se trouvent parfois considérablement limitées par leur prix de revient et leur relative instabilité du fait de leur nature protéique (sensibles à la température, au pH, aux ions). En solution, même si l’activité de l’enzyme est suffisante, sa récupération après utilisation nécessite un processus long et coûteux de purification. Par conséquent, ces enzymes sont perdues une fois la réaction effectuée : elles ne sont pas utilisables pour d’autres cycles de production. L’immobilisation des enzymes sur des supports solides, en augmentant leur stabilité opérationnelle et en permettant l’utilisation de réacteurs en flux continu permet de contourner cette difficulté. 2. Les enzymes immobilisés : C’est une enzyme liée par des moyens physiques ou chimiques (ou les deux en même temps) en surface ou à l’intérieure d’une matrice. Autrement dit c’est une enzyme fixé sur un support ou entouré par un enveloppe par l’utilisation de plusieurs méthodes possibles.  Choix de la matrice : Afin de choisir la matrice la plus appropriée pour une enzyme donnée il faut prendre en considération plusieurs points comme :  Résistance physique à la compression ;  Inertie vis-à-vis des enzymes ;  La facilité de production ;  Biocompatibilité (sa capacité de liaison) ;  La résistance aux attaques microbiennes ;  La stabilité contre la dégradation chimique et thermique ;  La rigidité structurelle ;  La durabilité lors de diverses applications ;  La disponibilité. Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique) Mr Hireche A 2  Avantage des enzymes immobilisées : L’utilisation des enzymes immobilisés dans le secteur industriel et biotechnologique représente des avantages très importants sur le plan pratique. Parmi ces avantages nous citons :  Une amélioration générale de la stabilité des enzymes ;  Une durée plus longue pour les enzymes utilisées grâce au manque des pertes ;  La récupération d’un produit sans enzyme (pure) donc une étape de la purification est évité ;  Utilisation répétés de la même enzyme ;  Possibilité de mettre fin al réaction à tout moment par l’élimination de l’enzyme insoluble. 3. Les méthodes d’immobilisation des enzymes : L’immobilisation artificielle des enzymes est possible grâce à plusieurs techniques. Ces techniques peuvent permettre la formation d’une liaison qui peut être aussi bien chimiques que physiques sur des matériaux ou supports insolubles. Les enzymes immobilisées peuvent être seulement confinés dans des matériaux de soutien sans aucune liaison (figure 1). Figure 1 : classification des méthodes d’immobilisation des enzymes. 3.1.Immobilisation des enzymes par fixation sur un support : 3.1.1. Fixation par liaisons physiques :  Adsorption : L’adsorption constitue la méthode la plus économique d’immobilisation des enzymes, c’est la plus simple et la plus rentable. L’adsorption repose sur la capacité de certains corps minéraux ou organiques à fixer une molécule donnée à leur surface. L’immobilisation est alors due à des interactions faibles de type Van der Waals, liaisons hydrogène, transfert de charges (liaisons ioniques), échanges d’ions ou encore à des interactions homophiles (hydrophobes et/ou hydrophiles). Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique) Mr Hireche A 3 Les supports adsorbants utilisés sont très variés, tant du point de vue de leur structure chimique que du point de vue de leurs propriétés physiques, nous citions dans ce cas :  Les supports organiques : comprennent les polyosides comme l’acétate de cellulose, nitrate de cellulose, dextrane, agarose, alginate et les polymères comme le polystyrène, le polyéthylène…  Les supports inorganiques (support minéraux) : comme la kaolinite, le verre poreux, des oxydes et des sels minéraux. Ce sont généralement plus stables, résistent l’usure, aux agents chimiques et aux bactéries. Les sels de métaux les plus utilisés sont les chlorures de titane (TiCl4), de zinc ou de fer. Les avantages de la technique : C’est une méthode très simple à mettre en œuvre nécessitant seulement de mettre en contact l’enzyme et le support dans des conditions de pH, température et de force ionique données. De plus elle est facilement réversible, économique et ne requiert aucun réactif chimique pouvant dénaturer l’enzyme. Les inconvénients de la technique : Elle présente un inconvénient majeur puisque, du fait des interactions faibles liant l’enzyme au support, ces systèmes sont peu stables, l’enzyme se désorbant au cours du temps. 3.1.2. Fixation par liaisons chimiques : L’immobilisation des enzymes par liaisons chimiques impliquent deux méthodes principalement, soit la fixation sur un support grâce à des liaisons covalentes ou bien par réticulation.  Immobilisation par liaisons covalentes sur support (le greffage covalent) : Le principe de cette méthode d’immobilisation est de faire réagir un groupement fonctionnel libre de l’enzyme avec un groupement fonctionnel du réactif (du support). Les groupements fonctionnels du support fréquemment utilisés sont le groupement carboxyle (COOH), thiols (SH), hydroxyle (OH) et amine (NH2). L’immobilisation de l’enzyme peut être directement sur le support (le groupement fonctionnel du support) sans avoir recoure à d’autres molécules. Dans ce cas en parle d’une immobilisation directe. Dans la plupart de temps les groupements fonctionnel sont insuffisamment réactifs, donc ils nécessitent une activation préalable. A priori, il faut activer soit l’enzyme, soit le support. L’activation des groupes du support est la plus utilisé car activation des groupes fonctionnels de l’enzyme peut conduire à la dénaturation de l’enzyme. Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique) Mr Hireche A 4 Figure 2 : Immobilisation par liaison covalente étap1 : activation du support, étape 2 : fixation de l’enzyme Les avantages de la technique : Cette méthode d’immobilisation présente principalement comme avantage de fixer l’enzyme de façon permanente et augmente la stabilité de celle-ci, lui conférant une durée de vie plus importante. Les inconvénients de la technique : Les réactifs indispensables au greffage risquent de dénaturer l’enzyme et donc de provoquer une perte d’activité.  Immobilisation par réticulation (sans support) : La réticulation repose sur l’utilisation d’agents dit réticulant qui va permettre de lier les enzymes entre elles par des liaisons chimiques. Il existe deux méthodes de réticulation, soit les enzymes sont reliées entre elles par des agents réticulant de façon directe, soit en plus de l’agent réticulant une protéine inerte peut être utilisée afin de faciliter ou améliorer la réticulation, on parle alors de Co-réticulation (figure 4). Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique) Mr Hireche A 5 Figure 3 : principe de la réticulation. Figure 4 : amélioration de la réticulation par les protéines inerte. Les avantages de la technique : Cette méthode d’immobilisation présente l’avantage d’être assez simple à mettre en œuvre comme elle offre aussi une bonne stabilité au système. Les inconvénients de la technique : Elle peut causer une perte de l’activité enzymatique au cours de la préparation. Cette méthode n’est pas adéquate pour des substrats de haut poids moléculaire. 3.1.3. Immobilisation d’enzyme par inclusion :  Inclusion dans un gel : Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau tridimensionnel d’un polymère insoluble dans l’eau « réseau tridimensionnel d’une matrice », ou emprisonnées dans des microcapsules délimité par une membrane semi perméable dont les pores sont suffisamment larges pour permettre le passage des molécules du substrat ou des produits de la réaction. On utilise comme matrice pour l’inclusion plusieurs polymères : - Gel à partir des polymères naturels : l’alginate, carraghénane, chitosane,…etc. Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique) Mr Hireche A 6 - Gels à partir des polymères synthétiques : le gel de polyacrylamide, fibres de polyacétate de cellulose.  Inclusion dans une fibre creuse : Les enzymes peuvent être piégés dans des microcavités de fibres synthétiques. Dans ce procédé, les flux de liquides circulent à l’intérieur des fibres, ayant pour avantage une diminution des phénomènes de polarisation de surface et de colmatages fréquents avec les membranes. Par contre cette méthode n’est pas adaptable aux enzymes qui pourraient être désactivés par des solvants non miscibles à l’eau.  Micro-encapsulation d’enzymes : Cette technique est couramment utilisée dans les industries pharmaceutiques, cosmétiques et alimentaires. L’émulsion d’une solution aqueuse renfermant l’enzyme avec un monomère hydrophile est réalisée dans un solvant organique chloroforme/cyclohexane non miscible à l’eau. Un agent tensioactif stabilisant l’émulsion est rajouté afin d’ajuster la taille des capsules aux dimensions désirées (1 à 100 microns). L’addition uploads/Finance/ chapitre-5-ge.pdf