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Chapitre I : Les outils enzymatiques du génie génétique II- Les enzymes de rest

Chapitre I : Les outils enzymatiques du génie génétique II- Les enzymes de restriction Définition : Enzymes bactériennes à l’origine d’un mécanisme de défense des bactéries vis-à-vis des virus : système de restriction-méthylation. Ce sont des endonucléases capables de cliver les liaisons phosphodiester entre les nucléotides à l’intérieur de séquences nucléotidiques spécifiques. Mécanisme d’action : Elles catalysent la coupure de l’ADN non méthylé en des endroits caractérisés par une séquence spécifique de nucléotides (4 à 10pb): site de restriction. Produits : Fragments de restriction, dont la longueur, toujours la même pour un ADN donné, ne dépend que de la séquence primaire de cet ADN. Système de restriction est donc un mode de défense des bactéries vis-à-vis des bactériophages, incluant des enzymes de restriction pour digérer l’ADN parasite et des enzymes de méthylation pour protéger l’ADN bactérien : • Les Bactéries sont lysées sous l’effet de virus bactériophages dont l’ADN est répliqué par la bactérie elle-même avant sa destruction. • Pour détruire l’ADN du parasite, la Bactérie exprime des gènes de restriction et de méthylation. • Les gènes de restriction permettent la synthèse d’endonucléases coupant l’ADN en des sites très spécifiques. • Afin de protéger l’ADN bactérien de l’hydrolyse par l’enzyme, une méthylase, codée par le gène de méthylation, va modifier les nucléotides de l’ADN bactérien en les méthylant pour qu’ils ne soient plus reconnus par l’enzyme de restriction. • L’ensemble du gène de restriction et du gène de méthylation constituent un système de défense de la Bactérie vis-à-vis des phages Applications : recherche de variations individuelles par RFLP (polymorphismes de longueur des fragments de restriction).C’est une des techniques d’analyse de la séquence primaire de l’ADN à la recherche de substitutions, d’insertions ou de délétions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur des fragments de restriction. RFLP Les fragments de restriction obtenus à partir d'un bout d'ADN dépendent de l'enzyme utilisée pour les générer ainsi que de la séquence de ce bout d'ADN puisque l'ER a une spécificité de coupure. Une mutation pourra, en modifiant la séquence primaire de l'ADN entraîner une modification de sa carte de restriction (un site qui disparaît ou au contraire qui apparaît). Il est déraisonnable de chercher à caractériser un génome complet par les fragments de restriction obtenus puisque même pour un génome relativement petit (bactérie de l'ordre de 106bp) une ER ayant un site de 6bp (un site toutes les (1/4)6 bp) donnera de l'ordre de 250 fragments (106/46) qui, par électrophorèse en gel d'agarose ne seront pas séparés et donneront une traînée. Pour être un repère fiable, un RFLP doit être identifiable sans aucune ambiguïté, il ne peut donc se trouver que dans une région non répétée du génome. Types de coupures des enzymes de restriction: Trois types d’enzymes de restriction ont été isolées à partir de bactéries : Type I: reconnaissent des sequences spécifiques dans l’ADN mais coupent aléatoirement, à une distance d’environ 1000 pb ou plus de la séquence de reconnaissance. Type II: reconnaissent des sequences spécifiques dans l’ADN et coupent le site reconnu. Type III: reconnaissent des sequences spécifiques dans l’ADN et coupent 25 pb plus loin. Ce sont les enzymes de restriction de type II qui sont employées en biologie moléculaire et reconnaissent des séquences palindromiques au sein de la molécule d’ADN. Remarque : Séquences palindromiques: séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’à 3’ (gauche-droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à 3’). Il existe deux types de coupures : Coupures décalées et coupures franches Les isoschizomères • Enzymes de restriction reconnaissant le même site de coupure • Elles peuvent avoir des sensibilités différentes à la méthylation • Ex. Hpa I et Msp I : CC/GG • Elles Peuvent couper la séquence de manière différente • Ex. Acc65 I : G/GTACC ; Kpn I : GGTAC/C Nomenclature Cette nomenclature n’obéit pas aux règles de l’IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), mais dépend de règles spécifiques qui tiennent compte de la bactérie dont a été isolée l’enzyme de restriction : • La dernière lettre majuscule n’est pas obligatoire pour toutes les endonucléases de restriction. Elle est représentative de la souche de la bactérie d’où l’enzyme a été isolée. Réaction de restriction • La réaction générale catalysée par les enzymes de restriction implique la présence dans le milieu réactionnel de l’enzyme, substrat (ADN double brin non digéré), produit (ADN double brin digéré), cofacteurs • En général, seul le Mg++ est indispensable. Quelques endonucléases font appel à d’autres cofacteurs. Les enzymes de méthylation ont pour coenzyme la S-Adénosyl-Méthionine (S- Ado-Met). • Des facteurs physiques contrôlent aussi ces réactions : pH, potentiel d’oxydoréduction, force ionique. L’énergie libre dégagée par l’hydrolyse est suffisamment importante pour que la réaction ne soit pratiquement pas réversible dans les conditions habituelles Tampons d’incubation • Différents tampons sont utilisés pour les enzymes de restriction permettant l’optimisation des réactions de multiples enzymes avec le même tampon. • Toutes les enzymes de restriction nécessitent la présence de l’ion Mg++ • Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel d’oxydo-réduction (dithiothréitol 1 mM), la force ionique (NaCl ou CH3COOK de 0 à 100 mM) varient d’un tampon à l’autre. • De rares enzymes nécessitent des conditions spéciales précisées par leur mode d’emploi II- Outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction II-1 Phosphorylation – déphosphorylation Polynucléotide kinase • Utilisation: incorporation du phosphate radioactif (32P) sur l’extrémité 5’ d’un acide nucléique. • La polynucléotide kinase du commerce est extraite d’E. coli infectée par le phage T4. • La polynucléotide kinase catalyse le transfert du phosphate γ de l’ATP sur une fonction alcool du carbone 5’ d’un ADN ou d’un ARN. • L’enzyme catalyse aussi l’échange du phosphate 5’ terminal d’un ADN ou d’un ARN avec le phosphate γ de l’ATP, en présence d’ADP comme accepteur de phosphate. Terminal transférase • Utilisation: construire des séquences polymérisées de nucléotides (queues) à l’extrémité 3’OH de l’ADN (en vue du clonage des fragments d’ADN) ; marquer les extrémités 3’ de l’ADN avec un nucléotide marqué sur le phosphate α ; ajouter un nucléotide à la fin d’une séquence pour induire une mutation (mutagénèse dirigée) • La transférase terminale du commerce est extraite du thymus de veau. • Catalyse l’addition de désoxynucléotides sur une fonction alcool 3’OH terminale de l’ADN. • Affinité pour les molécules d’ADN dont l’extrémité 3’OH est sortante, mais il existe des conditions qui favorisent la catalyse sur l’ADN à bouts francs, voire sur les extrémités 3’OH rentrantes. • Elle incorpore plus spécifiquement les purines ou les pyrimidines en fonction du cation divalent qu’on lui donne comme cofacteur : Mg++ pour les purines, Co++ pour les pyrimidines ou encore Mn++. Phosphatase alcaline • Utilisation: déphosphorylation des extrémités 5’ des acides nucléiques, pour préparer un marquage en 5’ par une polynucléotide kinase, ou pour empêcher la réannéalisation d’un ADN circulaire linéarisé. • La phosphatase alcaline du commerce est celle extraite de l’intestin de veau. • Ce sont des enzymes à très large spécificité, hydrolysant le radical phosphoryle porté par une liaison ester ou anhydride. • En fonction de leur pH optimum d’action on distingue: les phosphatases acides, et les phosphatases alcalines. • La réaction catalysée par les phosphatases est irréversible, mais certaines sont capables d’échanger le radical phosphate à partir de molécules plus riches en énergie comme le pyrophosphate. II. 2 Les polymérases ADN polymérase • Les ADN-polymérases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour répliquer l’ensemble du génome diploïde. • Les ADN polymérases sont des enzymes spécifiques de l’ADN double brin qui catalysent la synthèse de l’ADN à partir des désoxyribonucléosides triphosphates en recopiant la séquence d’une matrice d’ADN. • Certaines ADN polymérases interviennent dans la synthèse des amorces ARN/ADN, dans la réplication du génome mitochondrial ou dans la réparation de L’ADN. • Certaines d’entre elles ont aussi des activités d’exonucléase qui peuvent s’exercer de 5’ vers 3’ ou dans l’autre sens, afin de corriger les erreurs d’incorporation (fonction d’édition). • Ce sont en général des protéines d’environ 100000 daltons. Celles des êtres vivants les plus simples (virus, archéobactéries) sont souvent dépourvues de fonctions d’édition. • Substrats: désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces d’ARN et d’ADN synthétisées par une primase (RNA polymérase capable de synthétiser un brin d’ARN complémentaire d’un brin d’ADN sur 10 nucléotides) suivie d’une ADN polymérase α (qui prolonge l’amorce de RNA de 20 désoxyribonucléotides environ). • L’ADN néosynthétisé est sous forme de fragments (continu ou discontinu) qui, après excision des amorces, sont liés entre eux par une ADN-ligase. • L’Ion magnésium est nécessaire (obligatoire) à l’activité de l’ADN polymérase. Beaucoup d’entre elles fonctionnent en milieu alcalin. Leur température optimale d’action se situe habituellement dans une fourchette de 20 à 40 °C • ADN polymérase (fonction d’édition) • Les ADN polymérases ont à la fois une activité de polymérase et une activité de 3’→5’ exonucléase pour hydrolyser le dernier nucléotide incorporé. • Si le nucléotide incorporé n’est pas complémentaire uploads/Finance/ chapitre-i-genie-genitique.pdf