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Université De JIJEL Faculté des Sciences Département de Biologie Moléculaire et

Université De JIJEL Faculté des Sciences Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire Immobilisation des enzymes réalisé par: Boudjelida .H Bellal. Ch Kaaboub. K proposé par: Dr .Siffour M Année universitaire 2011-2012 Introduction la catalyse par les cellules microbiennes est peu efficace en raison de la perte du substrat due au besoin de croissance des microorganismes et de la présence des réactions secondaires gênantes, la possibilité d’extraire des enzymes et de les utiliser pour la conversion du substrat procure des avantages non négligeables quant au rendement et à l’uniformité du produit. Pour compenser les problèmes liés à l’instabilité et au cout d’extraction des enzymes en solution. On cherche à les immobiliser sur des supports insolubles afin de pouvoir les réutiliser après l’opération, et de faciliter leur séparation du produit de réaction obtenu. Par ailleurs, les enzymes immobilisées se prêtent mieux à leur incorporation dans les réactions ou l’entrée de substrat à un bout permet de récupérer le produit transformé à l’autre bout en flux continu. Qu’est ce qu’une enzyme immobilisée? Qu’elles sont les principales techniques d’immobilisation ? Qu’elles sont les domaines d’application d’enzymes immobilisées? Chapitre I : Généralités sur l’immobilisation des enzymes I.1. enzyme immobilisée • Une enzyme immobilisée est une enzyme liée par des moyens physico-chimiques en surface ou à l’intérieur d’un support solide • On cherche généralement à conserver son activité enzymatique, qui a tendance:  à diminuer après immobilisation du fait de possibles gênes stériques et de limitations dans l’accessibilité au site actif .  à augmenter sa stabilité dans le temps. I.2.But et principe d’immobilisation l’ultrafiltration est l’une des méthodes qui permet la réutilisation d’enzyme, mais il semble que celle qui a donné naissance aux plus grands développements consiste à rendre l’enzyme insoluble par un traitement physique ou chimique convenable, suffisamment doux et sélectif pour éviter une perte trop importante d’activité biologique. • On peut combiner les deux méthodes pour assurer une meilleure fixation de lˈenzyme. • La rétention physique exploite la grande différence de taille entre lˈenzyme et le substrat. Elle peut être un réseau, une capsule ou une membrane • Le traitement chimique se réalise par:  simple interaction ionique.  création d’une vraie liaison covalente. présente l’avantage de stabiliser la protéine et de permettre une utilisation prolongée. I.3.Propriétés d’enzymes immobilisées Propriétés physico-chimiques Une des propriétés importantes et caractéristiques de l’immobilisation est : l’amélioration de la stabilité dans le temps.  la résistance vis-à-vis de la dénaturation. • La stabilité de l’enzyme immobilisée dépend beaucoup du microenvironnement imposé par le support. On distingue normalement trois types de stabilité pour une enzyme immobilisée: Stabilité de stockage Stabilité opérationnelle Stabilité thermique Propriétés cinétiques • L’immobilisation des enzymes affecte beaucoup leurs propriétés cinétiques. • En effet, à la vitesse de réaction enzymatique proprement dite il faut ajouter l’effet du microenvironnement qui conditionne toute l’activité catalytique. • Ainsi, les phénomènes de diffusion limitent l’accès du substrat au niveau du site enzymatique I.4. Intérêts de l’immobilisation  Stabilité liée à une diminution du degré de liberté de la macromolécule et donc à une diminution des variations conformationnelles de l’enzyme. due à une augmentation de la concentration de la protéine locale.  Fonctionnement catalytique continu concerne les application préparatives avec les réacteurs les développement analytiques avec les biocapteurs.  Localisation de catalyseur Il est simple de séparer le catalyseur et les réactants au cours ou en fin de process.  Modulation de microenvironnement des enzymes charge, groupement hydrophobes, concentration locale des substrats et effecteurs.  Intérêt économique conduit à un abaissement des coûts de revient de la production du produit recherché de façon considérable.  Intérêt technologique conduit à un meilleur suivie et contrôle de la réaction catalytique. I.5.choix de technique Le choix dépend: du type d’enzyme utilisée ,  du transducteur et de l’environnement dans lequel le biocapteur fonctionne.  aussi des stabilités mécaniques et chimiques de la matrice et de son coût.  de l’application finale donnée à l’enzyme Chapitre II : Principales techniques d’immobilisation II.1. les méthodes d’immobilisation : II.1 Immobilisation d’enzyme par inclusion Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau tridimensionnel d’un polymère insoluble dans l’eau « réseau tridimensionnel d’une matrice », ou emprisonnées dans des microcapsules délimité par une membrane semi perméable dont les pores sont suffisamment larges pour permettre le passage des molécules du substrat ou des produits de la réaction. II.1.1 inclusion dans une matrice Figure1 : Inclusion dans un réseau de polymère insoluble. Inclusion dans un gel  L’enzyme est incorporée dans un gel insoluble. Ce gel peut être constitué d’une matrice organique (polymère) ou inorganique (argiles).  La maille de la matrice assure de manière purement physique la rétention de l’enzyme tout en permettant la diffusion du substrat jusqu’au site actif de l’enzyme grâce à une porosité du gel suffisante. Le choix du type de polymères va être dépend de :  Propriétés mécaniques du gel : compression, forces de cisaillement  Propriétés chimiques : toxicité, condition de stabilité en fonction de pH ;  Propriétés physiques : perméabilité du gel. Figure2 : inclusion dans un gel  On utilise comme matrice pour l’inclusion plusieurs polymères : Gel à partir des polymères naturels: l’alginate , Carraghénane, Chitosane…… Gels à partir des polymères synthétiques:  le gel de polyacrylamide. Figure 3 : inclusion dans le gel de polyacrilamide  fibres de polyacétate de cellulose On réalise une solution de triacétate de cellulose dans le chlorure de méthylène. on ajoute sous agitation une solution d’enzyme dans l’eau froide ou dans un tampon contenant de glycérol émulsion obtenue est ensuite extrudée sous pression d’azote dans un bain de coagulation contenant de toluène. La fibre obtenue est séchée sous vide pour éliminer les solvants et conserver à 5°C. Figure 4 : inclusion dans des fibres de polyacétate de cellulose. II.1.2. Inclusion à l’aide une matrice II.1.2.1 Microcapsulation La méthode consiste à inclure l’enzyme à l’intérieur de la membrane semi-perméable obtenue en copolymérisant un monomère hydrophobe, dessous dans la phase organique, et un monomère hydrophile, dessous dans la phase aqueuse en émulsion dans la phase organique. Les micro-capsules emprisonnant l’enzyme sont recueillies par centrifugation.Leur diamètre peut varier de quelques microns à une centaine de microns. Figure 5 : Inclusion dans des microcapsules. II .2.2. Membrane semi- perméable assure la rétention des molécule d’enzyme dans un volume déterminé en vue d’une utilisation continue (les hydrolase). Sont utilisées dans la dégradation des macromolécules (amidon, protéine). Les produits obtenus après l’hydrolyse peuvent franchir les membranes, ce que permet de les récupérer dans l’effluent selon la figure suivante : Figure7 : Inclusion à l’aide d’une membrane semi-perméable A: membranes planes, B:fibres creuses Avantages et inconvénients d’immobilisation par inclusion Avantage • Réaction de polymérisation et de gélification bien connues. • Réaction chimiques avec l’enzyme limitée (inclusion dans des gels naturels). • Application à toutes les enzymes (utilisation de mélanges). • Obtention de supports de forma adaptables (films, billes, fibre…) • Risque de fuite prévenue par réticulation du support après immobilisation. Inconvénients • Certaines polymérisations font appel à des agents dénaturants ou à des radicaux. • Problème de transfère de masse (inaccessibilité de certains substrats) • Risque de fuite de l’enzyme (micropores) • Propriétés mécaniques des gels insuffisantes. II.2.Immobilisation par adsorption C’est la méthode la plus simple et la plus rentable. elle consiste à assurer la rétention de la molécule enzymatique à la surface d’un support insoluble, par interaction faible entre les groupes fonctionnels de l’enzyme et du support. L’interaction enzyme-support pourra impliquer l’ensemble des liaisons non covalentes ou secondaires de bas niveau énergétique tel que les liaisons de Vander Waals, les liaisons hydrogène, les liaisons ioniques et le transfert de charge. Figure 8 : immobilisation par adsorption  Les supports utilisés  Les supports organiques Comprennent les polyosides comme l’acétate de cellulose, nitrate de cellulose, dextrane, agarose, alginate et les polymères comme le polystyrène, le polyéthylène…  Les supports inorganiques (support minéraux) sont généralement plus stables, résistent l’usure, aux agents chimiques et aux bactéries mais la fixation covalente sur ces support est difficile à cause de leurs faible réactivité. les matériaux actifs peuvent être des : * Les argiles * Verre poreux et silice poreuse Figure 9 : les supports inorganiques Autres supports : le nylon, oxyde céramique, cellulose, collagène et charbon actif. Les paramètres qui influencent l’adsorption  La concentration de l’enzyme  Le temps de contacte  Le pH Composition du milieu La température (effet positif) Avantages et inconvénients de l’immobilisation par adsorption  Avantages • Très grande facilité de mise en œuvre. • Possibilité de régénérer les complexes enzyme-support (si l’enzyme perd son activité en cours de son fonctionnement, il est possible de la désorber et de la remplacer par une préparation active) • Fixation rapide du support et immobilisation simple et non dénaturante.  inconvénients : • Malgré sa simplicité de mise en œuvre, elle demeure peu utiliser pour la conception des bioréacteurs (risque de désorption) • La fragilité de la fixation (les enzymes peuvent facilement se désorber sous l’action de variation de pH, température… • L’orientation de l’enzyme et mauvaise accessibilité au site actif. Figure 10: uploads/Finance/ immobilisation-des-enzymes.pdf