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Génie génétique 1. Préparation et extraction des ADN-ARN Préparation hématologi

Génie génétique 1. Préparation et extraction des ADN-ARN Préparation hématologique -A partir de sang frais ou décongelé (10 à 30 mL de sang), faire un choc thermique en ajoutant une solution hypotonique (permet de garder uniquement les leucocytes), réaliser une centrifugation. - Ajouter un détergeant SDS (détruit les membranes, libère l’ADN), et la protéinase K (détruit les histones et les protéines liés à l ADN) - Extraire l’ADN au phénol- chloroforme → le phénol permet la déprotéinisation de l’acide nucléique, et le chloroforme permet d’enlever toute trace de résidus. –Précipitation à l’éthanol glacial avec sel → permet de déshydrater l’ADN et le sel augmente la force ionique. (L’ADN précipite sous forme de filaments) -Solubilisation dans un tampon T10E1, pour maintenir la stabilité de l’ADN. Préparation à partir de tissus (réalisé durant les labos) - Découper le tissu, y ajouter le tampon de Lyse → destruction de la paroi- cellulosique. Constituants du tampon de Lyse : *NaCl : les ions Na+ neutralisent les phosphates de l’ADN → facilité l’aggrégation des molécules. *EDTA : inhibe l’action des Dnases en complexant les ions Mg 2+ → évite l’hydrolyse de l’ADN *SDS : détergeant ionique provoquant la dénaturation des protéines et la lyse de la membrane plasmique → libère l’ADN du noyau. –Filtrer la suspension obtenue -Ajouter l’alcool glacé → apparition d’un muqueux blanc d’ADN -Solubiliser l’ADN dans un tampon T10E1 Extraction Cette méthode consiste à éliminer toute sorte de contaminants pouvant être présent dans l’échantillon d’ADN. –Extraction au phénol- chloroforme : agiter l’échantillon, centrifuger à basse vitesse, récupérer la phase aqueuse qui contient les acides nucléiques. – Extraction à l’isobutanol : élimine les contaminants organiques, se fait après les étapes préables enzymatique ou de séparation. Précipitations Cette méthode permet de récupérer les acides nucléiques sous forme solide, et concentrés. – Précipitation à l’éthanol et sel : en ajoutant de l’éthanol, un précipité d’ADN y est récupéré. Pour ce faire, l’éthanol doit être glacé (-20°), contenir un sel (haute force ionique). Le rendement final est élevé. –Précipitation à l’isopropanol : l’ADN peut aussi être précipité à l’isopropanol pour de petits volumes. Il n’y a pas besoin de sel, retire les fragments de faible PM, rinçage à l’éthanol. Dosage des acides nucléiques Cette méthode permet de vérifier la qualité d’extraction de l’ADN par un spectrophotomètre. Pour estimer la contamination d’un échantillon, on procède en absorbant à une longueur d’onde de 260 nm et 280 nm. (Les protéines absorbent à 260 et 280 nm) Suite aux résultats obtenues, on effectue le rapport des 2 DO : ADN propre : DO 260/DO280 ₌ 1.8 à 2 Si le rapport est bas : restent des protéines. Si le rapport est haut : traces d’ARN ou petits fragments. 2. Séparation des ADN / ARN Ultracentrifugation La centrifugation est une technique analytique et préparative permettant la séparation des particules solides des substances en solution. -En gradient continu de CsCl : permet de séparer différents types d’ADN (chromosomiques et plasmidiques) dans un gradient de chlorure de césium → réservé aux purifications précises. -En gradient saccharose : permet de séparer les constituants cellulaires (membrane- cytosol) → classique et rapide. - En gradient discontinu (sur coussin) : préparation massives de phages. Remarques : Il est important d’équilibrer les centrifugeuses. En plaçant les tubes de masses égales en opposition. Si les masses sont trop différentes, possibilité d’équilibrer avec des tubes d’eau. Chromatographie - Exclusion moléculaire sur gel : utilisée pour une séparation en fonction du PM, retiens les nucléotides libres, les sondes non hybridées. - Echangeuse d’ion : retiens les acides nucléiques en raison de leur charge, retiens des petites quantités d’ADN après modification. - Chromatographie d’affinité : utilisée pour reconnaitre une séquence précise. (+/_) - HPLC : utilisée lorsque il faut une forte résolution en fonction de la taille, prépare les oligonucléotides de synthèse, les plasmides, les fragments,… Electrophorèse Technique de séparation analytique et préparative. L’électrophorèse n’est pas utilisée uniquement en méthode analytique, elle est aussi utilisée pour purifier les fragments d’ADN. La migration de l’ADN se fait à travers un gel réticulé dans un champ électrique. – les acides nucléiques anioniques migrent vers l’anode - la migration se fait en fonction de la masse moléculaire de l’ADN et le type de gel Types d’électrophorèse : - Gel d’agarose : convient pour la séparation de fragments d’ADN de tailles comprises entre quelques centaines de paires de bases et +- 20 Kb → très utilisé, la migration se fait à l’horizontal, le tampon utilisé pour cette migration est basique ( tris- Borate-EDTA). - Gel d’acrylamide : utilisé pour séparer des fragments d’ADN plus petits ; inférieur à 1Kb → la migration se fait à verticale entre 2 plaques de verre, très résolutif car purifie les oligonucléotides, détermine des séquences. - Electrophorèse en champs pulsés : permet de séparer des molécules de tailles allant jusqu’ à 10 Mb dans des gels d’agarose. Analyse des gels : - Le tampon de charge utilisé pour la migration électrophorétique permet un suivi des migrations en temps réel. (Role ?) – Coloration pendant et après la migration : * bromure d’éthidium, réactif mélangé à de l’ADN. Il s’intercale entre les brins d’ADN. * Détection réalisée par exposition aux U.V, fluorescence orange après réaction avec le BET - La migration est inversement propre au log du nombre de Pb obtenues → l’étalonnage se fait avec des marqueurs de poids moléculaires connues. uploads/Finance/ partie-1 2 .pdf