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La chromatographie La chromatographie, est méthode d'analyse physico-chimique,

La chromatographie La chromatographie, est méthode d'analyse physico-chimique, qui sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré) partition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile). Le mot chromatographie vient du grec ancien, chroma, qui signifie "couleur" et graphö, qui signifie "j'écris". LES GRANDES ÉTAPES DE L'ÉVOLUTION DE LA CHROMATOGRAPHIE 1906 - Le botaniste russe, M. TSWETT, publie son. livre: "Les chromophylles dans le monde végétal et animal", où sa méthode de séparation de pigments est décrite en détail. 1931 - KHUN et LEDERER séparent à une échelle préparative les carotènes et des xanthophylles. Le long sommeil de la méthode de Tswett est rompu ; elle se développe rapidement, grâce aussi aux travaux de BROCKMANN, KARRER, WINTERSTEIN et ZECHMEISTER. 1938 - REICHSTEIN introduit le "chromatogramme liquide" permettant des séparations de substances incolores. Cette forme de chromatographie est depuis, très largement utilisée. 1940-1943 - TISELIUS met au point ses méthodes d' "analyse frontale" et de "développement par déplacement". 1941 - MARTIN et SYNGE introduisent la chromatographie de partage sur gel de silice. Dorénavant, au lieu de quelques grammes de protéine, quelques milligrammes sont suffisants pour l'analyse des acides aminés neutres. 1944 - CONSDEN, GORDON et MARTIN inventent la chromatographie de partage sur papier, méthode très ingénieuse, permettant d'analyser non plus quelques milligrammes, mais quelques grammes d'acides aminés, de sucres, etc. 1940-1947 - WILSON, DEVAULT, WEISS, GLÜCKAUF, MARTIN, SYNGE et d'autres développent des théories détaillées de la chromatographie. 1947 - Un groupe de chercheurs américains, dont BOYD, MARINSKY, SPEDDING, TOMPKINS, etc., publient des détails de leurs travaux de séparation de terres rares et de corps radioactifs sur échangeurs d'ions. Ces recherches ont permis des séparations importantes à une échelle industrielle et sont à la base de la fabrication de certains isotopes actuellement sur le marché. La chromatographie s'est ainsi assurée une place importante en Chimie minérale. Principe La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation. Il s'agit de chromatographie analytique. Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions, de les récolter pour les identifier par d'autres techniques: c'est la chromatographie préparative. Paramètres intervenant dans la séparation Les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont : Paramètres type de chromatographie domaine d'application la charge électrique échange d'ions • protéines • polypeptides • acides aminés • acides nucléiques • sucres la taille et la forme (en fait, le volume) exclusion ou gel de filtration • protéines • polypeptides • acides nucléiques • sucres • lipides l'existence de structures particulières qui permettent d'établir des liaisons spécifiques affinité • protéines la polarité et/ou l'hydrophobicité polarité de phase inversée ou phase reverse • protéines • polypeptides • acides aminés • acides nucléiques • sucres • acides gras interactions hydrophobes • protéines Nature des phases: Phase fixe: La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM) La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux. Phase mobile: La phase mobile est: -soit un gaz (ex: chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur. -soit un liquide (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase mobile est appelée éluant. Classification des méthodes chromatographiques 1.Classification selon la nature physique des phases -Chromatographie liquide – liquide -Chromatographie liquide – solide - Chromatographie gaz – liquide - Chromatographie gaz – solide 2 .Classification selon le phénomène chromatographique Chromatographie d'adsorption Chromatographie de partage, Chromatographie par échange d'ions Chromatographie d'exclusion diffusion ou chromatographie sur gel 3.Classification selon le procédé utilisé Chromatographie sur colonne Chromatographie sur papier Chromatographie sur couche mince (CCM) Chromatographie par développement Chromatographie d'élution Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon la nature de la phase mobile : • la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ; • la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ; • la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ; • la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ; • la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais). On peut aussi les nommer selon les interactions développées par la phase stationnaire : • la chromatographie d'adsorption/d'affinité ; • la chromatographie de partage ; • la chromatographie à échange d'ions ; • la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL) ; • la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais). ou selon le support de la phase stationnaire : • la chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) ; • la chromatographie planaire (qui recouvre chromatographie sur couche mince et chromatographie sur papier) ; Enfin, un nouveau type de chromatographie commence à trouver des applications : la chromatographie à 2 dimensions. 1- La chromatographie sur papier La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne. Les différentes substances, constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. La chromatographie sur papier demande un certain temps (généralement plusieurs heures). Une fois l'opération terminée, généralement quand le front de solvant (éluant) est presque arrivé en haut du papier, le papier est retiré de la cuve et on laisse évaporer le solvant. Le résultat est appelé chromatogramme. Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'échantillon. Les substances peuvent être identifiées en calculant la valeur Rf qui peut être comparée à celles se trouvant dans les tables. Cette valeur est calculée de la façon suivante : Rf = (distance parcourue par l'échantillon) / (distance parcourue par le solvant) Il y a plusieurs façons d'identifier les endroits où se trouvent les produits ainsi séparés : 1. les produits sont colorés, il n'y a rien de spécial à faire. 2. les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette. 3. sinon, il faut utiliser un révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les détruisant) et dont le résultat sera coloré. Papier: On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du papier conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques sont uniformes. Les marques principales sont Whatman, Schleicher et Schüll, Durieux, Arches. Il existe huit catégories de papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur surface et la vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple le papier Whatman n° 1 est le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d'écoulement, on emploiera le n° 4; le papier n° 20 est très lent, mais il permet une meilleure séparation , donnant des taches très denses uploads/Finance/ cours-chromato-m1-bgv.pdf