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Cours Méthodes d’Analyses Chromatographiques CHAPITRE I GÉNÉRALITÉS SUR LA CHRO

Cours Méthodes d’Analyses Chromatographiques CHAPITRE I GÉNÉRALITÉS SUR LA CHROMATOGRAPHIE Généralités sur la Chromatographie 2 Chapitre I Généralités sur la Chromatographie 1. Définition La chromatographie est une méthode physique d’analyse basée sur la séparation de constituants d’un mélange ; les différents constituants de ce mélange appelés solutés sont séparés et entraînés par un fluide (un liquide ou gaz) que l’on appelle phase mobile ; ils interagissent ou au contraire n’interagissent pas avec une phase fixe que l’on appelle phase stationnaire qui exerce sur eux un effet retardateur. L'origine du mot chromatographie vient peut-être de la séparation de composés colorés puisque chroma () en grec, signifie couleur et graphein signifie écrire. 2. Historique La chromatographie est une science très ancienne. Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Au XVIème siècle, le strasbourgeois Brunswig purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à travers une éponge imprégnée d'huile d'olive et réalisait une expérience de chromatographie gaz-liquide, 400 ans avant la découverte de cette technique. En 1931, la publication de Kuhn et Lederer sur la séparation des isomères du carotène et de la xanthopylle apparue. En effet, c’est Kuhn qui, en 1938 reçut le Prix Nobel sur la chromatographie en phase mince. En 1952, les travaux de Martin ont mis en évidence la chromatographie d’échange ionique et en 1941 la naissance de la chromatographie de partage par Martin-Synge. En 1955 la chromatographie gaz-liquide sur le marché et en 1965 l’apparition la chromatographie liquide moderne (HPLC). L’excellente séparation des molécules, aussi bien les grosses que les petites rend la chromatographie une technique largement répandue. 3. Classification des techniques chromatographiques Les méthodes chromatographiques se classent en trois façons: 3.1. Classification selon la nature physique des phases Selon la nature de la phase mobile on distingue: la chromatographie en phase liquide (CPL) la chromatographie en phase gazeuse (CPG) la chromatographie en phase supercritique (CPS) Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: la chromatographie liquide/solide (CLS) la chromatographie liquide/liquide (CLL) la chromatographie gaz/solide (CGS) la chromatographie gaz/liquide (CGL) 3.2. Classification selon le mécanisme de rétention Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules à séparer. On distingue ainsi: la chromatographie d'adsorption, de partage, d'échange d'ions, d'exclusion et la chromatographie d'affinité. 3.3. Classification selon la technique mise en jeu Selon la technologie mise en jeu on distingue: la chromatographie sur colonne la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche mince). Chromato. d’adsorption Chromato. d’échange d’ions Polarité faible ou moyenne Polarité élevée Molécules ionisées ou ionisables Molécules non ionisées 4. Choix de la technique Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes. Le choix de l’une ou l’autre dépend : 1. de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,… 2. du but de l’analyse : identiﬁcation, contrôle de pureté, puriﬁcation de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres, dosages, quantiﬁcation… Chromatographie d’exclusion correspond à la séparation des molécules de masses moléculaires supérieures à 2000 Échantillon de MM  2000 Chromato. de partage phase normale Chromato. de partage phase inverse L’existence de structures particulières dans la molécule exige l’utilisation de la chromatographie d’affinité. La chromatographie en phase gazeuse convient aux molécules gazeuses ou volatilisables. Chromatographie en phase supercritique utilisée pour séparer les molécules thermolabiles et de masses moléculaires élevées. Les méthodes électrophorétiques conviennent aux molécules soumises à un champ électrique 5. Terminologie et grandeurs de rétention 5.1. Chromatogramme Un chromatogramme est un diagramme montrant l’évolution du signal du détecteur (par rapport à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution (plus rarement du volume d’élution). Ce graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative. Analyse qualitative : permet l’identiﬁcation des composés par la position du pic Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d’un composé en utilisant l’aire des pics 5.2. Elution L’élution est l’entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de la phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile peut être appelée éluant. 5.3. Le temps mort Le temps mot (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire de la colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne (ou temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne). 5.4. Le temps de rétention Le temps de rétention (tr) est le temps mis par les molécules d’un composé à analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne. Le temps de rétention est caractéristique d’une espèce pour des conditions d’analyse données et peuvent servir à l’analyse qualitative. La surface et la hauteur d’un pic est fonction de la quantité du constituant. Le temps de rétention est indépendant de la quantité d’échantillon injectée. Il est fonction de la nature et la vitesse de la phase mobile (Fig.1). 5.5. Le temps de rétention réduit Le temps de rétention réduit (tr’) représente le temps passé par le soluté dans la phase stationnaire. tr’= tr - tm 75 50 25 0 0 5 10 15 Minutes Fig.1: Chromatogramme d’un constituant 5.6. Le volume de rétention Connaissant le débit D de la phase mobile, supposé maintenu constant, on définit le volume de rétention (Vr) Vr = tr xD Vr = tr x u. s. ɛ  u: vitesse linéaire moyenne de la phase mobile s : selection droite de la colonne ɛ : porosité de la phase stationnaire ( 0,75 pour la silice poreuse) t r H ω l 3,264 10,848 Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume mort) peut être calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non retenu par la phase stationnaire. Cette grandeur est exprimée par : Vm= tm x D Le volume de la phase stationnaire désigné par VS est calculé en retranchant du volume total interne de la colonne vide le volume de la phase mobile. 5.7. Vitesse linéaire moyenne du soluté et de la phase mobile La vitesse linéaire moyenne de progression du soluté v est égale à : V = L/tr L : longueur de la colonne La vitesse linéaire moyenne de la phase mobile u est égale à : u = L/tm 5.8. Le facteur de capacité Le facteur de capacité (ou facteur de rétention) k’ exprime le rapport de la quantité de soluté dans la phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase mobile. Ce facteur sans dimension, peut être relié au temps de rétention par l’expréssion: K’= (tr-tm)/tm k' est aussi le rapport du temps passé par une espèce dans la phase stationnaire au temps passé par cette même espèce dans la phase mobile. De faibles valeurs de k’ indiquent des composés peu retenus. Des valeurs élevées de k’ indiquent des composés fortement retenus, en pratique 1  k’10. Le temps et le volume de rétention sont liés au facteur de capacité par les relations : tr = tm(1+ k’) et vr= vm(1+ k’) 5.9. Facteur de sélectivité Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on utilise le facteur de sélectivité ou de séparation . Ce facteur est égal au rapport des facteurs de capacité de deux solutés dont on veut réaliser la séparation. Il s’exprime par : Avec k2’ > k1’  = (tr2 - tm) = k2’/ k1’ (tr1 - tm ) Il s’agit du rapport des temps de rétention réduits k2’: facteur de capacité du composé 2 k1’: facteur de capacité du composé 1  = 1 aucune séparation ne s’effectue aussi le temps de rétention est le même. La sélectivité doit être supérieure à 1. Deux composés ne peuvent être séparés sauf s’ils ont k’ 0 6. Efficacité d’une colonne L'efficacité d'une colonne chromatographique est mesurée, pour chaque composé, par le nombre de plateaux théoriques N de la colonne et la hauteur équivalente à un plateau théorique H. Cette théorie est née de la recherche d'un modèle statique permettant de décrire le fonctionnement d'une colonne chromatographique comme celui d'une colonne à distiller. Au lieu de considérer le déplacement réel, continu de la phase mobile, on admet que celle-ci progresse par sauts successifs et se met en équilibre avec la phase stationnaire entre deux transferts, ce qui permet de découper fictivement la colonne en un certain nombre de zones dans lesquelles les équilibres sont réalisés et que l'on appelle plateaux théoriques. Les pics d'élution peuvent être assimilés à des courbes de Gauss. Les caractéristiques géométriques de la courbe de Gauss (Fig.1) permettent de calculer, pour un soluté donné, N à partir du chromatogramme. N=16(tr/l) l: largeur du pic à la base Avec l= 1,7 ω N=5.54(tr/w) ω : largeur du pic à mi-hauteur Pour comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs on définit la hauteur équivalente à un plateau théorique. N=L/H H : est la distance ou l’équilibre chromatographique est atteint. En HPLC les HEPT sont comprises entre 0,001 et 1 mm L’efficacité des colonnes chromatographiques uploads/Finance/ cours-chromato-methode-analyse-2021.pdf