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See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/271516531 Evaluation de l'activité antioxydant des composés phénoliques par la réactivité avec le radical libre DPPH Article · January 2009 CITATIONS 115 READS 38,641 3 authors, including: Some of the authors of this publication are also working on these related projects: Project No. 15.817.02.30A “Development of methods and techniques for modernization of nuts (Juglans Regia L.) processing technology using their biologically active constituents in the functional foods” (NUCALIM-PROBIO) View project Independent Project for Young Researchers No. 16.80012.51.23A “Innovative product from goat milk with high biological properties” (InoBioProd) View project Cristina Popovici Technical University of Moldova 111 PUBLICATIONS 231 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Cristina Popovici on 10 July 2017. The user has requested enhancement of the downloaded file. Revue de génie industriel 2009, 4, 25-39 __________________________________________________________________________ 26 Revue de Génie Industriel ISSN 1313-8871 http://www.revue-genie-industriel.info Evaluation de l’activité antioxydant des composés phénoliques par la réactivité avec le radical libre DPPH Cristina Popovici 1, Ilonka Saykova 2*, Bartek Tylkowski 2 1 Université technique de Moldova, Kisinew, Moldavie 2 Université de technologie chimique et de métallurgie, Sofia, Bulgarie * Auteur correspondant: Ilona Saykova; Université de technologie chimique et de métallurgie, bul. Kliment Ohridski 8, 1756 Sofia, Bulgarie ; e-mail : i.seikova@uctm.edu Révisé et accepté le 20 novembre 2009 / Disponible sur Internet le 20 décembre 2009 Résumé Ce travail s’inscrit dans le cadre de la valorisation des extraits des pépins de raisin en tant qu’antioxydants. La méthode appliquée pour mesurer une activité antioxydant est celle du piégeage des radicaux libres à l'aide du DPPH• Les facteurs qui influencent la réactivité au radical libre DPPH• et les protocoles publiés ont été discutés. À des fins comparatives sont testées des solutions modèles de composés appartenant à des familles phénoliques distinctes (solutions d’acide gallique, d’épicatéhine, d’acide tannique et de leurs mélanges). Les propriétés antioxydantes ont été mesurées et mises en évidence par la concentration efficace CE50 et par la cinétique de réduction. Les résultats indiquent une variation de CE50 de 30.8÷86.6 mg antioxydant/g DPPH• et des temps de réaction TCE50 entre 5 et 30 minutes, corrélés avec leur structure chimique et la teneur en composés phénoliques. Abstract This works is inscribed in the frame of valorization of grape seeds extracts as antioxidants. The method applied to measure the antioxidant activity was the free radical scavenging by using DPPH•. The factors that influence DPPH• radical reduction kinetics and the analytical protocols published are discussed. For comparison purposes, model solutions of compounds of distinct phenolic families (single solutions of gallic acid, epicatechin, tannic acid and their mixtures) were tested. The antioxidant proprieties were measured and evidenced in terms of their efficient concentration EC50, as well as their reduction kinetics. The results indicate a variation of EC50 between 30.8÷86.6 mg antioxidant/g DPPH• and times of reaction TEC50 from 5 to 30 minutes, in correlation with their chemical structure and the content of phenolic compounds. Mots-clés: antioxydant, polyphénols, DPPH, activité anti-radicalaire, cinétique de réduction Keywords: antioxidant, polyphenols, DPPH, radical scavenger, reduction kinetics Introduction Ces dernières années, l’intérêt porté aux antioxydants naturels, en relation avec leurs propriétés thérapeutiques, a augmenté considérablement. Des recherches scientifiques Revue de génie industriel 2009, 4, 25-39 __________________________________________________________________________ 27 dans diverses spécialités ont été développées pour l’extraction, l’identification et la quantification de ces composés à partir de plusieurs substances naturelles à savoir, les plantes médicinales et les produits agroalimentaires [1,2,3]. L’activité antioxydante d’un composé correspond à sa capacité à résister à l’oxydation. Les antioxydants les plus connus sont le β-carotène (provitamine A), l’acide ascorbique (vitamine C), le tocophérol (vitamine E) ainsi que les composés phénoliques. En effet, la plupart des antioxydants de synthèse ou d’origine naturelle possèdent des groupes hydroxyphénoliques dans leurs structures et les propriétés antioxydantes sont attribuées en partie, à la capacité de ces composés naturels à piéger les radicaux libres tels que les radicaux hydroxyles (OH•) et superoxydes (O2•) [4-7]. Plusieurs méthodes sont utilisées pour évaluer, in vitro et in vivo, l’activité antioxydante par piégeage de radicaux différents, comme les peroxydes ROO• par les méthodes ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) et TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter) [8] ; les ions ferriques par la méthode FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Parameter) [9]; ou les radicaux ABTS• (sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique) [10], ainsi que la méthode utilisant le radical libre DPPH• (diphényl-picrylhydrazyle) [11]. Compte tenu de la complexité des processus d’oxydation et la nature diversifiée des antioxydants, avec des composants à la fois hydrophiles et hydrophobes, il n’y a pas une méthode universelle par laquelle l’activité antioxydante peut être mesurée quantitativement d’une façon bien précise. Le plus souvent il faut combiner les réponses de tests différents et complémentaires pour avoir une indication sur la capacité antioxydante de l’échantillon à tester [12,13,14]. De point de vue méthodologique, le test au radical libre DPPH• est recommandé pour des composés contenant SH-, NH- et OH- groupes [15]. Il s’effectue à température ambiante, ceci permettant d’éliminer tout risque de dégradation thermique des molécules thermolabiles. Le test est largement utilisé au niveau de l’évolution des extraits hydrophiles en provenance de thé vert, des jus de fruits et de raisins, pépins et pulpes, très riches en composés phénoliques [16-27]. Dans ce cadre, l’étude s’est intéressée à l’évaluation des activités antioxydantes d’extraits de pépins de raisin en vue de leur valorisation en tant qu’antioxydants. Une étude comparative a été réalisée à partir des protocoles analytiques publiés afin d’évaluer l’effet des facteurs qui influent sur la méthode de mesure de la capacité anti- radicalaire à l’aide du DPPH•. Comme exemple d’illustration les cinétiques de réduction du DPPH• réagissant avec l’acide gallique, l’épicatéchine et l’acide tannique ont été étudiées afin d’estimer la différence d’efficacité entre différentes familles de composés phénoliques présents dans les pépins de raisins. L’objectif de l’étude est de proposer une technique rapide et reproductible permetant de comparer les extraits vis-à-vis de leur action sur les phénomènes du piégage des radicaux libres. Cette classification permettra de choisir les conditions les plus adéquates lors des différentes étapes de la valorisation de la matière première: extraction, purification et concentration en fonction d’un critère de qualité optimal : d’une part la teneur en composés phénoliques et parallèlement, leur activité anti- radicalaire. Principe de la methode Réaction entre le radical libre DPPH• et l’antioxydant Le composé chimique 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (α,α-diphényl-β-picrylhydrazylе) fut l’un des premiers radicaux libres utilisé pour étudier la relation structure-activité antioxydant des composés phénoliques [28,29]. Il possède un électron non apparié sur un atome du pont d’azote (Fig.1). Du fait de cette délocalisation, les molécules du radical ne forment pas des dimères, i.e. DPPH• reste dans sa forme monomère relativement stable à température ordinaire. La délocalisation provoque aussi la couleur Revue de génie industriel 2009, 4, 25-39 __________________________________________________________________________ 28 bleue bien caractéristique de la solution de DPPH•. La mesure de l’efficacité d’un antioxydant se fait en mesurant la diminution de la coloration bleue, due à une recombinaison des radicaux DPPH•, mesurable par spectrophotométrie à 515-518 nm. Figure 1. Structure chimique du radical libre DPPH• (2,2 DiPhenyle-1-Picryl-Hydrazyle) Le piégeage des radicaux libres par des antioxydants est tributaire de deux types de mécanismes: (i) la libération de l’atome d’hydrogène du groupement hydroxyle (cinétique rapide de certaines acides et dérivées phénoliques) ; (ii) la libération d’un électron (cinétique lente des dérivées glycosylées et des anthocyanes) [3,18]. Dans le cas des composés phénoliques (Φ-OH), le mécanisme principal d’action est le piégeage des radicaux libres par le transfert de l’atome H sur le DPPH• alors transformé en une molécule stable DPPHH [30,31] : DPPH•+ ΦOH → DPPHH + ΦO• Plusieurs voies réactionnelles sont alors possibles qui forment des structures plus au moins stables : ΦO•+ ΦO• → ΦO-OΦ DPPH•+ ΦO•→ ΦO-DPPH ΦO• (semi-quinone)- H• → Φ=O (quinone) La capacité anti-radicalaire (capacité à fixer des radicaux libres, donc à arrêter la propagation de la réaction en chaîne) ne peut être mesurée directement, mais par contrôle de l’effet de la réactivité. Plusieurs facteurs influent sur le potentiel antioxydant et la cinétique de réduction, notamment les conditions de la réaction (temps, rapport Antioxydant/DPPH•, type de solvants, pH) et le profil phénolique en particulier [30]. Evaluation du potentiel anti-radicalaire Pour l’évaluation de l’activité antioxydante, deux approches sont appliquées : d’une part, la détermination de la réduction relative du radical DPPH•à un temps de référence ou la détermination de la quantité d’antioxydant nécessaire pour réduire 50 % de DPPH• et d’autre part, le suivi de la cinétique de la réduction [31,32]. Dans la première approche, l’activité est définie par l’indice de la réduction de l’activité anti-radicalaire en pourcentage %RSA (Radical Scavenger Activity), où l’absorbance du mélange réactionnel qui contient le radical libre et l’échantillon de l’antioxydant est reliée avec l’absorbance du mélange sans aucun antioxydant (solution témoin ou contrôle) à un temps t : [%RSA=(Abscontrôle – Abst)/ Abscontrôle x 100%]. Comme il n’existe pas de mesure absolue de la capacité antioxydante d’un composé, les résultats sont souvent portés par rapport à un antioxydant de référence, comme l’acide ascorbique (vitamine C), les antioxydants synthétiques BHT (butyl-hydroxy-toluène) ou le Trolox® (acide-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique), uploads/Finance/ ergi-4-popovici.pdf