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73 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1993, 132, 73-89 ÉTUDE CHROMATOGRAPHIQUE DE L'HU

73 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1993, 132, 73-89 ÉTUDE CHROMATOGRAPHIQUE DE L'HUILE ESSENTIELLE DE LA PLANTULE DE FENOUIL AMER (FOENICULUM VULGARE MILL.) ; CARACTÉRISTIQUES SPECTRALES (UV, IR, SM) DE SES CONSTITUANTS (*) A. LAMARTI (**), A. BADOC (***), J.-P. CARDE (****) L’huile essentielle de plantules cultivées in vitro de Fenouil amer, Foeniculum vulgare Mill. subsp. vulgare var. vulgare, a été analysée par chromatographie en phase gazeuse soit directement à l’aide d’une plaque D.C.I., soit après extraction au pentane et purification par passage sur une colonne de gel de silice. On observe peu de différence entre les 2 méthodes. A côté du dillapiole, composé majoritaire, on trouve d’autres arylpropènes fortement oxydés. Ces derniers ont été purifiés par chromatographie sur couche mince préparative et les caractéristiques spectrales sont données. L’obtention des isomères cis et trans à partir de la myristicine et du dillapiole est décrite. (*) Manuscrit reçu le 22 Décembre 1993. (**) Département de Biologie, Faculté des Sciences Mhanach II, BP 2121 Tetouan, Maroc. (***) Laboratoire de Mycologie et Biologie végétale, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université de Bordeaux II, 3, place de la Victoire, 33000 Bordeaux Cedex (****) CNRS URA 568, Laboratoire de Physiologie cellulaire végétale, Université de Bordeaux I, av des Facultés, 33405 Talence Cedex. 74 INTRODUCTION Le Fenouil est une Apiacée médicinale, aromatique et industrielle et une des principales sources d’anéthole, principe des boissons anisées (1,2), avec l'Anis vert (Pimpinella anisum L., Apiaceae) et la Badiane de Chine (Illicium verum Hook., Illiciaceae). L'hémisynthèse à partir de l'estragole tiré du Pin maritime n'est pas autorisée en France pour les applications alimentaires. L’huile essentielle de cette espèce a fait l’objet de nombreuses études (3,4). La teneur en essence des différentes parties de la plante et son profil présentent une importante variabilité génotypique. À celle-ci s’ajoute une variabilité due à l’environnement, aux conditions de culture, de récolte, d’extraction et d’analyse. Le Fenouil amer correspond à Foeniculum vulgare Mill. subsp. vulgare var. vulgare chémotype (= chémodème) trans-anéthole (3). Depuis plusieurs années, nous travaillons sur des cultivars améliorés par la Société CERES et le Centre de Recherche Pernod Ricard. Avant nos travaux (4), l’essence aux premiers stades de croissance du Fenouil a été étudiée par peu d’auteurs. Tóth a trouvé sur de jeunes plantes une majorité de trans-anéthole (5). Croteau et al. (6) ont signalé la présence de 60-70 % d'arylpropènes dans les feuilles de plants de 16 à 24 jours. Fujita et al. (7) ont trouvé 90,3 % de dillapiole dans la plantule entière de 42 jours en culture hydroponique. Pour la première fois, tous les composés détectés ont été déterminés avec précision, en ayant recours à diverses techniques spectrophotométriques. MATÉRIEL ET MÉTHODES Matériel végétal Le Centre de Recherche Pernod Ricard nous a fourni des fruits d'un cultivar "Cérès 25" de Fenouil amer sélectionné par la Société CERES. Culture in vitro Après stérilisation, les akènes sont mis à germer dans des boîtes de Petri sur de l'eau gélosée à 24°C avec un éclairement d'une intensité de 600 lux (2,5 W.m-2) fourni 18 heures par jour. Après trois jours de culture, les akènes germés sont transférés dans des tubes à essais à raison d'un par tube. Ces derniers contiennent 15 ml d'eau gélosée (0,6 %), sont bouchés par du coton hydrophile, recouverts d'une feuille d'étain et placés dans les mêmes 75 conditions que précédemment. Les plantules obtenues présentent ainsi un même stade de développement. Extraction par le pentane Nous avons utilisé du pentane bidistillé. Ce solvant solubilise la plupart des constituants des essences, extrait moins de pigments que l'éther ou le méthanol, permet de concentrer les extraits sans perte des constituants très volatils, vu son faible point d'ébullition. L'essence est obtenue par broyage à température ambiante d'une vingtaine de plantules dans du pentane en présence de sulfate de sodium anhydre. A plusieurs reprises, on verse un peu de pentane, on broie et on récupère au fur et à mesure à l'aide d'une pipette Pasteur le surnageant dans une fiole de 25 ml. Le poids de matière sèche est évalué à partir du résidu d'extraction placé dans des boîtes de Petri après dessiccation dans une étuve à 60°C. Purification et fractionnement de l'extrait Afin de séparer les composés de poids moléculaire élevé (pigments), on utilise une colonne (10 x 1,5 cm) de gel de silice 60 (70-230 mesh, Merck). Les hydrocarbures monoterpéniques sont élués par 30 ml de pentane et les composés oxygénés par 30 ml d'éther éthylique. Les 2 fractions sont réunies, concentrées sous un très faible courant d'azote et additionnées d'un volume exact (0,1 ml) d'une solution d'étalon interne, l'œnanthate d'éthyle (= heptanoate d'éthyle) à 0,6 g/l dans du pentane bidistillé. Chromatographie en phase gazeuse L'extrait purifié est immédiatement analysé à l'aide d'un chromatographe Intersmat IGC 16 à détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne capillaire apolaire CPSil-5CB de 25 m x 0,22 mm d.i. et 0,25 µm d'épaisseur de film (Chrompack). Les conditions opératoires sont les suivantes : débit d'azote (1 ml/2,5 min), programmation de température (60°C 10 min, puis 60 à 280°C à raison de 4°C/min), volume injecté (2 µl), diviseur de flux (1/100), sensibilité (10-11), températures de l'injecteur et du détecteur (200 et 250°C), intégrateur Spectra Physics 4100, vitesse de déroulement du papier (5 mm/min). Platine D.C.I. La platine D.C.I. (Désorption-Concentration-Introduction) permet une analyse directe de l'essence sans extraction préalable. Elle accepte les échantillons solides (secs ou humides) et liquides. Son principe est très simple. Une plantule de Fenouil amer, coupée en 4 morceaux est placée dans une nacelle dans un four à désorption thermique (10 min à 100°C) balayé par un courant de gaz inerte (0,5 bar d'azote). On introduit 0,1 ml d'étalon interne (solution d'œnanthate d'éthyle à 0,6 g par litre de pentane bidistillé) 76 en même temps que le matériel végétal. Les composés volatils sont concentrés sur un piège de tenax refroidi à -10°C par l'azote liquide pendant 15 min. Puis l'injection est réalisée par passage rapide du piège de tenax de -10 à + 200°C. La séparation et la détection sont obtenues par un chromatographe Di700 (Delsi) équipé d'une colonne capillaire CPSil-5CB (25 m x 0,22 mm d.i.) et d'un détecteur à ionisation de flamme. Les conditions opératoires utilisées sont les mêmes que précédemment. La surface des pics est mesurée par un intégrateur Delsi Enica 21. Le résidu végétal restant dans la nacelle est récupéré pour l'estimation du poids de matière sèche. Obtention des arylpropènes Le cis-anéthole a été obtenu par isomérisation du trans-anéthole sous l'effet d’un rayonnement ultraviolet à 254 nm (8,9). 50 mg de trans-anéthole sont dilués avec 100 ml de pentane bidistillé dans une fiole Pyrex. La solution est placée à 10 cm d'une source UV (254 nm). Les arylpropènes fortement oxydés ne sont pas commercialisés ou difficiles à se procurer à l'état pur. Nous sommes donc partis de fruits d'Aneth d'Inde (Anethum graveolens L., Apiaceae), riches en dillapiole (10,11) et de Persil (Petroselinum crispum (Mill.) A.W. Hill, Apiaceae), riches en myristicine (12). L'extraction a été réalisée à température ambiante par trois broyages successifs d'environ 0,2 g de méricarpes avec du pentane bidistillé et du sulfate de sodium anhydre dans un mortier. Chromatographie préparative sur couche mince Nous avons réalisé une chromatographie ascendante sur plaque de gel de silice 60 F254 (Merck) de 1 mm d'épaisseur avec un support en verre (20 x 20 cm). Les cuves sont saturées 24 heures avec, comme phase mobile, un mélange chloroforme : benzène (75:25, v/v). La hauteur de développement est de 15 cm. La myristicine et le dillapiole sont détectés à 254 nm, élués par l'éthanol absolu et stockés à l’obscurité pour éviter une isomérisation à la lumière (13). Isomérisation alcaline Les isomères cis et trans de l'isomyristicine et de l'isodillapiole sont obtenus de la myristicine et du dillapiole par hydrolyse alcaline (14). Cette réaction fait passer les allylbenzènes (prop-2-ényl) en propénylbenzènes (prop-1-ényl) cis et trans. À 30 ml d'éluat obtenu à partir de la CCM préparative, on ajoute dans un tube à essai (200 x 15 mm) 4 paillettes de KOH soit environ 350 mg. Le tube est fermé hermétiquement, placé dans un bain-marie à 75°C pendant 24 heures. Après refroidissement, l'éthanol est éliminé par évaporation sous vide à 40°C. Le résidu est repris avec 20 ml de pentane et concentré sous un faible courant d'azote. 77 Spectrophotométrie ultraviolet Les spectres UV dans l'éthanol absolu ont été enregistrés sur un appareil Beckman modèle 25. Spectrophotométrie infrarouge Les spectres infrarouge ont été enregistrés au moyen d'un spectrophotomètre Bomem à transformées de Fourier (FTIR) couplé à une imprimante Panasonic Digital Plotter VP-6803P. Les éthers-oxydes fortement concentrés dans l'éthanol ont été déposés entre deux lames de NaCl. Spectrométrie de masse L'identification des composés a été réalisée par couplage CPG/SM au CÉSAMO (Centre d'Étude Structurale et d'Analyse des Molécules Organiques) à l'Université de Bordeaux I. Basse résolution. Les spectres sont obtenus sur un spectromètre de masse Fisons- Instruments Auto Spec-Q couplé à un chromatographe en phase gazeuse Packard 5890 muni d'une colonne capillaire CPSil-5CB (50 x 0,32 mm d.i.) et d'un détecteur à ionisation de flamme. Le mode uploads/Finance/ pentane-et-he.pdf