Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

www.inrs.fr/metropol Endotoxines M-154 - 11/2015 Page 1 / 6 Endotoxines M-154 C

www.inrs.fr/metropol Endotoxines M-154 - 11/2015 Page 1 / 6 Endotoxines M-154 Cette méthode décrit le prélèvement en mode Actif sur cassette et l'analyse par spectrophotométrie de la (des) substance(s) : Endotoxines Substances Informations générales Nom Endotoxines Nom Endotoxines Substance données de validation Endotoxines Validation_161 Famille de substances AGENTS BIOLOGIQUES BIOAEROSOLS Principe et informations Principe de prélèvement et d'analyse Domaine d'application Substance Endotoxines Données de validation Validation partielle Numéro de la méthode M-154 Ancien numéro de fiche 089 Les endotoxines sont des lipopolysaccharides (LPS) "présents dans la membrane externe des bactéries à GRAM négatif . Ce sont des molécules complexes, de poids moléculaire élevé (2 000 à 20 000 daltons), constituées à la fois d‘une partie polysaccharidique et d’une partie lipidique. La partie lipidique, appelée "le lipide A", est composée de deux dérivés de glucosamine sur lesquels sont attachés 3 à 4 acides gras ainsi que des phosphates et pyrophosphates. Le lipide A est responsable des activités toxiques du LPS. La partie polysaccharidique est composée de deux éléments, une partie appelée le "polysaccharide central" (noyau interne et externe) et une partie appelée "chaîne latérale O". La composition chimique du polysaccharide central varie d’une espèce à une autre. Chez Salmonella, il est constitué de 10 sucres possédant une structure particulière. La "chaîne latérale O" ou "antigène O" est une chaîne polysaccharidique courte directement liée au polysaccharide central. Sa composition varie d’une espèce à une autre mais également au sein d’une même espèce. Le polysaccharide est responsable des activités antigèniques du LPS. Les endotoxines peuvent être libérées lors de la croissance et de la lyse cellulaire et être présentes dans les bioaérosols. A l’heure actuelle, il n’existe ni VLE, ni VME pour les endotoxines en milieu professionnel. Toutefois, la valeur de 200 Unités d’Entotoxines/m (UE/m ) est adoptée aux Pays-Bas et est régulièrement évoquée dans la littérature. Principe L’échantillonnage de l’air est effectué par filtration sur filtre en fibre de verre à l’aide de cassettes porte-filtre. Les endotoxines sont extraites à partir des filtres par agitation dans de l’eau purifiée stérile et apyrogène et le dosage des endotoxines dans les extraits est effectué par la méthode au lysat d’amoebocytes de limule (LAL). 3 3 Etat physique Particules en suspension (liquides ou/et solides) Type de prélèvements Actif Technique analytique SPECTROPHOTOMETRIE www.inrs.fr/metropol Endotoxines M-154 - 11/2015 Page 2 / 6 Liste des réactifs manpi des labo 1 1http://www.inrs.fr/media.html?refINRS=ED%20953 Méthode de prélèvement Prélèvement des aérosols par cassette fermée 2 2http://www.inrs.fr/dms/inrs/PDF/metropol-prelevement-cassette.pdf EDSA ENDOTOXINES LYOPHILISEES DE ESCHERICHIA COLI 055:B5 REACTIF LAL LYOPHILISE Dispositif de prélèvement Conditions de prélèvement Pompe de prélèvement Pompe à débit de 1 à 5 L/min compensant les fortes pertes de charges (sup, à 20 pouces d'eau) Conditionnement particulier Compléments Toutes les dispositions concernant l'assemblage et l'étanchéité des cassettes devront être vérifiées. La préparation des cassettes de prélèvement est effectuée sous PSM en déposant un porte-filtre en cellulose puis un filtre en fibre de verre Nombre d'éléments (dispositifs) composant le dispositif en série 1 Type de dispositif CASSETTE 37 mm 3 pièces Support ou substrat de collecte FILTRE FIBRE DE VERRE TAMPON EN CELLULOSE Préparation du substrat : Les filtres en fibre de verre sont dépyrogénéisés à l'étuve à 250°C pendant 90 minutes. Commentaires, conseils, consignes : La préparation des cassettes de prélèvement est effectuée sous PSM (Poste Sécurité Microbiologique) en déposant un tampon cellulose puis un filtre en fibre de verre à l'aide d'une pince stérile. La cassette est ensuite correctement assemblée puis fermée avec des bouchons. Elle doit être étanche. Il est recommandé d'utiliser un lot de cassettes non ouvert et stocké à l'abri de la lumière et la poussière. Débit (L/min) 2 Temps de prélèvement maximum en heures 8 Particularités, commentaires, conseils : Volume de prélèvement recommandé : entre 300 et 400 L Choix conditionnement particulier autre Description : Toutes les dispositions concernant l'assemblage et l'étanchéité des cassettes devront être vérifiées. Les échantillons sont transportés le plus rapidement possible au laboratoire dans une enceinte réfrigérée à 4°C. Dans tous les cas, les échantillons doivent être analysés dans les 24 heures après le prélèvement. Remarque : Le peu de données disponibles actuellement ne permet pas de mieux préciser les conditions de conservation des filtres après l'échantillonnage. www.inrs.fr/metropol Endotoxines M-154 - 11/2015 Page 3 / 6 Méthode d'analyse Principe général de l'analyse en laboratoire 4 4http://www.inrs.fr/dms/inrs/PDF/metropol-analyse-principe.pdf La préparation des cassettes de prélèvement est effectuée sous PSM en déposant un porte-filtre en cellulose puis un filtre en fibre de verre préalablement dépyrogénéisé à l’étuve à 250°C pendant 90 min, à l’aide d’une pince stérile dans chaque cassette de diamètre 37 mm. La cassette est ensuite correctement assemblée (pression suffisante pour éviter les fuites) puis fermée avec des bouchons. Il est recommandé de préparer ces cassettes à partir d’un lot non ouvert de cassettes stockées à l’abri de la lumière et de la poussière. Préparation des dispositifs de prélèvement en vue d'une intervention en entreprise 3 3http://www.inrs.fr/dms/inrs/PDF/metropol-intervention-preparation.pdf 1 condition analytique : Condition analytique n° 1 Préparation de l'analyse 1 étape de préparation : Etape de préparation n° 1 Commentaires, conseils ou conditions particulières Chaque filtre est extrait de sa cassette d’échantillonnage puis est transféré dans un tube conique en polypropylène, stérile et apyrogène, contenant 10 mL d’eau distillée stérile apyrogène. Le tube est ensuite agité pendant 60 minutes à l’aide d’un vortex à 2 000 tr/min. L’extraction est complétée par une étape de centrifugation. L’extrait est centrifugé pendant 10 min à 4°C et 2000g. Durée de conservation testée et validée pour les prélèvements 1jour(s) Conditions de conservation testée et validée pour les prélèvements 4°C Nombre d'étapes de préparation 1 Commentaires sur les étapes : Tout matériel utilisé doit être vérifié et certifié apyrogène à une concentration inférieure à 0.005EU/ml et ne doit pas interférer dans le dosage des endotoxines notamment par absorption des endotoxines sur les parois. Solvant ou solution EAU Type de préparation Extraction Volume 10mL Temps d'agitation 60min Commentaires : Extraction des endotoxines à partir des filtres dans un volume de10 mL d’eau purifiée stérile et apyrogène. Agitation 60 min à 2 000 rpm à l’aide d’un vortex. Centrifugation des extraits pendant 10 min à 4°C et 2000g. Filtration éventuelle des extraits s’ils restent troubles après centrifugation. Remarque : Traiter les témoins de la même façon. En cas de dépôt évident de poussières sur les parois de la cassette, un lavage de la cassette après retrait du filtre de prélèvement et du pad peut être réalisé et les endotoxines dosées séparément. Technique analytique SPECTROPHOTOMETRIE Commentaires, conseils ou conditions particulières : Dosage des endotoxines dans les extraits Le dosage des endotoxines dans les extraits doit être effectué le plus rapidement possible après l’extraction. Ce dosage est effectué avec la méthode cinétique et chromogénique au LAL. La présente procédure décrit une méthode de dosage utilisant le kit LAL Kinetic- QCL. Le dosage des endotoxines est réalisé sur deux exemplaires des solutions décrites dans le tableau 1. Pour chaque échantillon, une dilution au 1/10 voire au 1/100 peut être effectuée. Préalablement à l’analyse, les échantillons sont correctement identifiés et un plan de plaque est prédéfini. e e www.inrs.fr/metropol Endotoxines M-154 - 11/2015 Page 4 / 6 Étape n° 1 : Préparer la gamme étalon. Étape n° 2 : Préparer les échantillons. Les extraits sont dilués successivement au 1/10 dans de l’EDSA. Les tubes en verre stériles et apyrogènes sont utilisés pour cette opération et le taux de dilution est fonction de la concentration attendue en endotoxines. Étape n° 3 : Distribuer les échantillons dans la plaque de microtitration. La gamme étalon, les témoins (contrôles positifs, contrôles négatifs) et les échantillons sont distribués dans une plaque de microtitration stérile et apyrogène, dans les puits appropriés (plan de plaque prédéfini) et à raison de 100 µL par puits. Étape n° 4 : Pré-incubation de la plaque de microtitration. La plaque de microtitration est ensuite introduite dans le lecteur puis incubée à 37°C pendant 10 minutes. Étape n° 5 : Préparer le réactif LAL. La préparation du réactif LAL est effectuée au cours des dix minutes de pré-incubation de la plaque de microtitration à l’aide des flacons contenant le réactif LAL lyophilisé et d’EDSA présents dans le kit. Le réactif est préparé en ajoutant à chaque flacon de réactif LAL lyophilisé le volume d’EDSA indiqué par le fournisseur. Le mélange est ensuite homogénéisé délicatement. Si la préparation nécessite plusieurs flacons de réactif LAL, homogénéiser chaque flacon séparément puis regrouper la totalité du réactif préparé dans un seul flacon. Étape n° 6 : Distribuer le réactif LAL dans la plaque de microtitration. Le réactif LAL préparé est distribué, à l’aide d’un distributeur Combitypâ, dans les puits appropriés (plan de plaque prédéfini) de la plaque de microtitration pré-incubée et à raison de 100 µL par puits. La réaction s’initie dès lors que le réactif LAL est mis en contact avec une solution contenant des endotoxines. Aussi, la distribution du réactif LAL doit être aussi régulière que possible et sa durée ne doit pas excéder 90 secondes (le logiciel déduit 5 secondes par colonne). Étape n° 7 : Incubation et lecture. La plaque uploads/Finance/ fichemetropol-metropol-154.pdf