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0 THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER En Bioc

0 THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER En Biochimie et Physicochimie alimentaire École doctorale GAIA – Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau Unité de recherche UMR IATE - CIRAD Valorisation des composés phénoliques de colza et de tournesol : du fractionnement des matières premières à la synthèse de molécules multifonctionnelles Présentée par Oscar LAGUNA Le 13 février 2019 Sous la direction de Jérôme LECOMTE Devant le jury composé de Catherine SARAZIN, Professeure, Université de Picardie, Amiens Marie-Hélène ROPERS, Chargée de Recherche, INRA, Nantes Frédérique CARRIERE, Directeur de Recherche, CNRS, Marseille Romain KAPEL, Maître de Conférence, Université de Lorraine, Nancy Valérie LULLIEN-PELLERIN, Directrice de Recherche, INRA, Montpellier Jérôme LECOMTE, Chargé de Recherche, CIRAD, Montpellier Jérôme LE NÔTRE, Directeur R&D SAS PIVERT, Compiègne Rapporteure Rapporteure Examinateur, Président du jury Examinateur Examinatrice Directeur de thèse Invité 1 Valorisation des composés phénoliques de colza et de tournesol : du fractionnement des matières premières à la synthèse de molécules multifonctionnelles Résumé : Les tourteaux de colza et de tournesol, principalement utilisés en alimentation animale pour leur forte teneur en protéines, représentent des sources d’acides phénoliques aux propriétés antioxydantes et bioacives variées mais peu valorisées à ce jour. Par ailleurs, les procédés de séparation de ces composés sont basés sur des extractions par solvants qui génèrent des effluents et impactent l’intégrité des autres composants des matières premières. La première partie de ce travail de thèse a été consacrée au développement de nouveaux procédés de séparation de la fraction phénolique des tourteaux de colza et de tournesol. Après un broyage adéquat des tourteaux, le fractionnement par tri électrostatique et turbo-séparation a permis d’obtenir des fractions enrichies en protéines et composés phénoliques. Dans les deux cas, l’état granulométrique des tourteaux broyés a été déterminant. Le tri électrostatique a conduit aux plus forts taux d’enrichissement en protéines et composés phénoliques (jusqu’à deux fois la concentration dans les tourteaux) avec des rendements de l’ordre de 30% après recyclages. Cette étape a été suivie par l’extraction de la fraction phénolique par des mélanges hydro-alcooliques « verts » à base d’éthanol, en substitution au méthanol. Dans la deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la production enzymatique des acides sinapique et caféique, à partir des tourteaux ou de leurs extraits. Trois cinnamoyl estérases recombinantes d’A. niger aux activités et spécificités différentes ont été testées. L’hydrolyse des tourteaux non traités thermiquement s’est traduite par une dégradation des composés phénoliques par des enzymes endogènes. Le problème a pu être contourné en réalisant l’hydrolyse sur l’extrait phénolique des tourteaux avec néanmoins, dans le cas du colza, l’existence de réactions secondaires néfastes au rendement en acide sinapique. La dernière partie a consisté en la synthèse de mono- et di-esters d’acide sinapique et caféique avec différents α,ω-diols aliphatiques, puis l’évaluation de leur capacité antioxydante en milieu émulsionné et en milieu homogène. Un effet négatif de la mono-estérification des acides phénoliques a été observé en milieu hétérogène montrant ainsi l’influence négative du groupement hydroxyle situé à l’extrémité de la chaîne alkyle. Un effet de seuil a été observé, en revanche, avec les deux familles de di-esters d’acides phénoliques, indiquant une amélioration de la capacité antioxydante jusqu’à un optimum correspondant à une longueur de chaine alkyle particulière. Enfin, tous les mono- et di-esters testés en milieu homogène ont montré une capacité antiradicalaire plus faible que celle des acides phénoliques de départ correspondants. Mots-clés : colza et tournesol, composés phénoliques, fractionnement par voie sèche, traitements enzymatiques, lipophilisation, capacité antioxydante Valorization of rapeseed and sunflower phenolics : from the dry fractionation of raw materials to the synthesis of multifunctional molecules Abstract : Rapeseed and sunflower meals are highly abundant and protein-rich by-products mainly dedicated to animal feed. Besides, they also represent an interesting source of phenolic compounds with various bioactive and antioxidant properties, but widely untapped so far. In addition, the recovery processes of phenolic compounds are based on the use of solvents that generate effluents and may negatively affect the integrity of other meal constituents. The first part of this work was devoted to the development of new separation processes of rapeseed and sunflower meal phenolic fraction. After an appropriate milling of the meals, the dry fractionation by electrostatic sorting or air classification allows the recovery of proteins and phenolics enriched fractions. In both cases, the particle-size distribution of milled meals has been of paramount importance on process efficiency. Electrostatic sorting lead to the highest enrichments in proteins and phenolics (up to two times more than in starting meals) with recovery yields around 30% after recycling. This step was followed by the extraction of phenolics using green hydro-alcoholic mixtures based on ethanol, as substitutes to methanol. In the second part, we investigated the enzymatic production of sinapic and caffeic acids from rapeseed and sunflower meals or their extracts. Three recombinant cinnamoyl esterases from A. niger exhibiting different activities and selectivities were tested. Owing to the presence of active endogenous enzymes, the hydrolysis of non-thermally treated meals has led to a significant loss of phenolics. The issue was overcome by performing hydrolysis on the corresponding phenolic extracts. However, in case of rapeseed extract, acyl transfer reactions were detrimental to sinapic acid formation and yield. Finally, in the last part, we synthesized mono- and di-esters of sinapic and caffeic acids with aliphatic α,ω-diols of increasing chain length, then we evaluated their antioxidant capacities in emulsion and in homogenous medium. A negative impact of the mono-esterification of the phenolic acid with the different aliphatic diols was observed in the heterogeneous medium, implying the negative influence of the hydroxyl group at the end of the alkyl chain. Conversely, a “cut-off” effect was observed for the two di-esters series showing an improvement of the antioxidant capacity until an optimum was reached for a particular alkyl chain. Finally, all the esters showed lower antiradical capacities in the homogenous medium compared to the corresponding starting phenolic acids. Key words: rapeseed and sunflower, phenolic compounds, dry fractionation processes, enzymatic treatments, lipophilisation, antioxidant capacity 2 TABLE DES MATIERES Travaux relatifs à cette thèse ........................................................................................................................ 7 Remerciements ............................................................................................................................................. 8 Liste des figures ........................................................................................................................................... 11 Liste des tableaux ........................................................................................................................................ 14 Liste des schémas ........................................................................................................................................ 16 Liste des abréviations .................................................................................................................................. 17 INTRODUCTION GÉNÉRALE ........................................................................................................................ 21 CHAPITRE 1 : ETAT DE L’ART ....................................................................................................................... 26 1. FILIERE OLEAGINEUSE ET CONTEXTE GENERAL ................................................................................... 26 2. LE COLZA ET LE TOURNESOL ................................................................................................................ 27 2.1. UTILISATIONS PRINCIPALES DES GRAINES ................................................................................... 27 2.2. MORPHOLOGIE ET COMPARTIMENTATION DES GRAINES DE COLZA ET DE TOURNESOL .......... 29 2.3. LES TOURTEAUX DE COLZA ET DE TOURNESOL ........................................................................... 31 2.3.1. Les tourteaux comme sources de protéines ....................................................................... 31 2.3.2. Facteurs antinutritionnels des tourteaux de colza et de tournesol .................................... 33 2.3.2.1. Les fibres ...................................................................................................................... 33 2.3.2.2. Les phytates ................................................................................................................. 33 2.3.2.3. Les glucosinolates ........................................................................................................ 33 2.3.2.4. Les composés phénoliques .......................................................................................... 34 2.3.3. Caractérisation fine des composés phénoliques de la graine de colza ............................... 35 2.3.3.1. Les tannins condensés ................................................................................................. 35 2.3.3.2. Les flavonoïdes ............................................................................................................ 36 2.3.3.3. Les acides phénoliques et leurs dérivés ...................................................................... 37 2.3.4. Caractérisation fine des composés phénoliques de graine de tournesol ........................... 38 2.3.4.1. Les flavonoïdes ............................................................................................................ 38 2.3.4.2. Les acides phénoliques et leurs dérivés ...................................................................... 38 2.4. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ET BIOACTIVES DES COMPOSES PHENOLIQUES .................. 39 2.4.1. Propriétés antioxydantes et antiradicalaires ...................................................................... 40 2.4.2. Application des composés phénoliques à la maîtrise de l’oxydation lipidique. .................. 44 3. FRACTIONNEMENT PAR VOIE SECHE DE LA BIOMASSE ...................................................................... 45 3.1. ETAPE DE BROYAGE ..................................................................................................................... 47 3 3.2. ETAPE DE SÉPARATION ................................................................................................................ 49 3.2.1. Tri électrostatique ............................................................................................................... 49 3.2.2. Turbo-séparation ................................................................................................................. 52 4. PRETRAITEMENTS ENZYMATIQUES DES MATIERES PREMIERES POUR LA LIBERATION D’ACIDES PHENOLIQUES ............................................................................................................................................. 53 4.1. HYDROLYSE D’ESTERS D’ACIDES PHENOLIQUES PAR VOIE ENZYMATIQUE ................................ 55 4.1.1. Production des FAEs ............................................................................................................ 55 4.1.2. Utilisation des feruloyl estérases pour la libération d’acides phénoliques ......................... 57 5. EXTRACTION DES COMPOSES PHENOLIQUES SIMPLES DES TOURTEAUX DE COLZA ET DE TOURNESOL 60 5.1. EXTRACTIONS AUX SOLVANTS ..................................................................................................... 60 5.2. QUANTIFICATION DES COMPOSES PHENOLIQUES SIMPLES ....................................................... 62 6. LA LIPOPHILISATION COMME OUTIL POTENTIEL D’AMELIORATION DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63 6.1. METHODES D’EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ....................................................... 64 6.2. VOIES DE SYNTHESES POUR LA LIPOPHILISATION DES COMPOSES PHENOLIQUES .................... 66 6.2.1. Voie chimique ...................................................................................................................... 67 6.2.2. Voie enzymatique ................................................................................................................ 69 6.2.3. Voie chimio-enzymatique .................................................................................................... 70 6.3. MISE EN EVIDENCE DE L’EFFET DE SEUIL DE L’HYDROPHOBIE SUR L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE EN SYSTEMES LIPIDIQUES DISPERSES ...................................................................................................... 72 6.4. EFFET DE LA LIPOPHILISATION DES ACIDES PHENOLIQUES SUR LEUR CAPACITE ANTIRADICALAIRE EN MILIEU HOMOGENE. ............................................................................................ 75 7. CONCLUSIONS ET OBJECTIFS ............................................................................................................... 78 CHAPITRE 2 : MATÉRIELS ET MÉTHODES ................................................................................................... 80 1. MATERIELS ........................................................................................................................................... 80 1.1. RÉACTIFS ...................................................................................................................................... 80 1.2. MATIÈRES PREMIÈRES ................................................................................................................. 80 2. METHODES .......................................................................................................................................... 81 2.1. METHODES CHROMATOGRAPHIQUES ANALYTIQUES ET PREPARATIVES ................................... 81 2.1.1. Analyses par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) .................................. 81 2.1.1.1. Détermination des teneurs en composés phénoliques individuels et totaux dans les échantillons de colza ....................................................................................................................... 81 4 2.1.1.2. Détermination des teneurs en composés phénoliques individuels et totaux des échantillons de tournesol ................................................................................................................ 82 2.1.2. Caractérisation par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) des principaux composés phénoliques dans les extraits méthanoliques uploads/Finance/ composes-phenoliques-du-colza.pdf